Μελέτη της επίδρασης του ωσμωτικού στρες στον πολλαπλασιασμό και τη γήρανση κυττάρων μεσοσπονδύλιου δίσκου

Abstract

The proper function of intervertebral disc cells is necessary for the maintenance of a healthy tissue. Given the unusual physicochemical conditions of this particular tissue in comparison to other tissues (acidic pH, low oxygen concentration, nutirients’ deficiency and high osmolality), the deeper understanding of disc cells’ physiology and responses in the concept of their peculiar extracellular microenvironment is of great importance. The aim of this dissertation was to investigate the effect of different stresses confronted by the intervertebral disc in its native environment on cellular proliferation and senescence. Cells’ proliferation rate was estimated directly with the development of growth curves and indirectly by measuring cell’s ability for novel DNA synthesis, as assessed by tritiated thymidine incorporation. Cell cycle analysis was performed by flow cytometry after labeling of the cells with propidium iodide or simultaneous labeling with propidium iodide and an antibody raised against the phopshorylated form of histone H3, which is a known mitotic marker. Protein expression or activation was examined by Western analysis, while for intracellular localization immunofluorescence experiments were performed. The participation of protein-targets in particular pathways was studied using specific pharmacological inhibitors, cell lines not expressing p53 or ATM kinase and a siRNA molecule for p53 gene silencing. Single cell gel electrophoresis (comet assay) was used in order to explore the possibility of DNA damage and cells’ repairing capacity was measured after transfection of the cells with a vector carrying a reporter gene which was previously damaged exogenously. Finally, senescent cells were characterized microscopically, with immunofluorescence experiments for bromodeoxyuridine incorporation and after SA β-gal staining for senescent cells. In the present thesis we showed that the physicochemical conditions of intervertebral disc’s extracellular environment affect the proliferation and the biochemical behavior of its cells. We found that hyperosmotic stress provokes a rapid p38-MAPK-dependent cell cycle arrest at the G2 phase and a delayed G0/G1 arrest regulated by p53. We revealed for the first time that high salinity causes DNA damage to disc cells which respond to this insult by activating a typical response to genotoxic stress that is enhanced under hypertonic conditions. We finally demonstrated that the continuing presence of high osmolality in the extracellular environment leads the cells to premature senescence in vitro.

Η καλή λειτουργία των κυττάρων του μεσοσπονδύλιου δίσκου είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της υγείας του ιστού. Δεδομένης της ιδιαιτερότητας των φυσικοχημικών συνθηκών που επικρατούν στο συγκεκριμένο ιστό σε σχέση με άλλους ιστούς (όξινο pH, χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου, έλλειψη θρεπτικών συστατικών και υψηλή ωσμωμοριακότητα) είναι σημαντική η βαθύτερη κατανόηση της φυσιολογίας και των αποκρίσεων των κυττάρων του δίσκου μέσα στο πλαίσιο του ιδιαίτερου εξωκυτταρικού τους μικροπεριβάλλοντος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των διαφόρων μορφών στρες που φυσιολογικά υφίσταται ο μεσοσπονδύλιος δίσκος στον πολλαπλασιασμό και τη γήρανση των κυττάρων του. Η εκτίμηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων έγινε άμεσα με καμπύλες ανάπτυξης και έμμεσα μέσω της ικανότητας των κυττάρων για σύνθεση νέου DNA, όπως αυτή υπολογίζεται με πειράματα ενσωμάτωσης τριτιωμένης θυμιδίνης. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου έγινε με κυτταρομετρία ροής μετά από την επισήμανση των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο ή την ταυτόχρονη επισήμανσή τους με ιωδιούχο προπίδιο και με αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης μορφής της ιστόνης H3, το οποίο επισημαίνει ειδικά τα μιτωτικά κύτταρα. Η μελέτη της έκφρασης ή ενεργοποίησης των πρωτεϊνών έγινε με ανάλυση Western και ο ενδοκυτταρικός τους εντοπισμός με ανοσοφθορισμό. Η συμμετοχή των πρωτεϊνών-στόχων σε συγκεκριμένες κυτταρικές αποκρίσεις διερευνήθηκε με τη χρήση ειδικών φαρμακολογικών αναστολέων, κυτταρικών σειρών που δεν εκφράζουν την p53 ή την κινάση ATM και μικρών παρεμβαλλόμενων μορίων siRNA για την αποσιώπηση του γονιδίου της p53. Η πιθανότητα πρόκλησης βλαβών στο DNA των κυττάρων μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση ολόκληρων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (comet assay), ενώ η ικανότητά τους για επιδιόρθωση εκτιμήθηκε μετά από επιμόλυνση των κυττάρων με πλασμίδιο που φέρει γονίδιο αναφοράς και στο οποίο είχαν προκληθεί προηγουμένως βλάβες εξωγενώς. Τέλος, ο χαρακτηρισμός των γηρασμένων κυττάρων έγινε με μικροσκοπική παρατήρηση, με πειράματα ενσωμάτωσης βρωμοδεοξυουριδίνης και με τη χρήση της ειδικής χρώσης γηρασμένων κυττάρων SA β-gal. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχθηκε ότι οι φυσικοχημικές συνθήκες που επικρατούν στο εξωκυτταρικό περιβάλλον του μεσοσπονδύλιου δίσκου επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό και τη βιοχημική συμπεριφορά των κυττάρων του. Ειδικότερα έγινε σαφές ότι το υπερωσμωτικό στρες προκαλεί μια ταχεία αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2 που εξαρτάται από την p38-MAPK και μια πιο καθυστερημένη αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1, η οποία ρυθμίζεται από την p53. Για πρώτη φορά αποκαλύφθηκε η πρόκληση βλαβών στο DNA των κυττάρων αυτού του ιστού από την υψηλή αλατότητα αλλά και η ενισχυμένη ικανότητά τους για επιδιόρθωση σε υπερτονικό περιβάλλον μέσω ενός κλασικού μονοπατιού απόκρισης σε γενοτοξικό στρες. Τέλος, βρέθηκε ότι η συνεχής παρουσία υψηλής ωσμωμοριακότητας στο εξωκυτταρικό περιβάλλον οδηγεί σε πρόωρη κυτταρική γήρανση in vitro. Μελλοντικό στόχο αποτελεί η διερεύνηση των παραπάνω φαινομένων in vivo.