Ο ρόλος της πρόωρης γήρανσης στρωματικών κυττάρων στην καρκινογένεση

Abstract

Cellular senescence is considered to be a potent anticancer mechanism. However, it has been proposed that senescent stromal cells may enhance the growth of adjacent malignant epithelial cells. Exposure of tumours to repeated low doses of chemotherapeutic drugs and ionizing radiation is a common treatment regime in several tissues. However, the effect of this stress to the neighboring stromal cells and the interaction of the latter with cancer cells has not been adequately investigated. In this study we have exposed confluent cultures of human lung fibroblasts and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM-MSC) to repeated subcytotoxic doses of Taxol, Cisplatin, Doxorubicin, STI571 and ionizing radiation. We have found that a single dose of Cisplatin and Doxorubicin, but not Taxol and STI571, immediately activates a DNA damage response, as shown by the activation of ATM/Chk2/p53/p21CIP1/WAF1 axis. After a series of doses with Cisplatin, Doxorubicin and Taxol but not STI571, cellular senescence was accelerated, as shown by morphological alterations, growth arrest, p21CIP1/WAF1 and p16INK4A upregulation and senescence-associated β galactosidase staining. Interestingly, we found that in the case of γ-radiation-induced premature senescence this process is p53-dependent. Next, we studied the effect of these prematurely senescent cells on the growth of human malignant lung cell lines (A549). Medium conditioned by young and prematurely senescent cells has a slightly inhibitory effect on the proliferation of A549 cells. Furthermore, in co-culture studies we have found that the growth of cancer cells was merely enhanced when cultured on drug-induced prematurely senescent fibroblasts. In addition, in immunocompromised mice taxol-induced, as well as cisplatin-induced senescent cells intensely promoted A549 cells to form tumours. In addition, prematurely senescent fibroblasts secrete MMP that are in part responsible for the synergy between senescent and cancer cells in tumor growth.Furtermore we investigated the effect of chemotherapeutic drugs and in some cases ionizing radiation on the ability of hBM-MSC towards adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation and we found that both chemotherapeutic drugs and ionizing radiation significantly diminished MSCs’ ability towards differentiation. These findings support the idea that replicative- or stress-induced senescence of stromal cells represent a major challenge for tissue homeostasis.

Η κυτταρική γήρανση θεωρείται ένας ισχυρός αντικαρκινικός μηχανισμός. Παρόλα αυτά πληθαίνουν διαρκώς οι ενδείξεις για τη συμμετοχή του γηρασμένου στρώματος στη διέγερση της ανάπτυξης των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων. Σκοπός, λοιπόν, της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η κατανόηση των μηχανισμών, σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, που διέπουν τη σχέση όγκου και γηρασμένου στρώματος. Και πιο συγκεκριμένα των στρωματικών πνευμονικών ινοβλαστών των οποίων η γήρανση έχει προκληθεί από την έκθεση των τελευταίων είτε σε χημειοθεραπευτικές ενώσεις είτε σε ακτινοβολία γ, δεδομένου ότι η έκθεση των όγκων σε επαναλαμβανόμενες μη-κυτταροτοξικές δόσεις αντικαρκινικών ενώσεων και ακτινοβολίας γ εφαρμόζεται ευρέως στην αντιμετώπιση των νεοπλασιών κατά τη χημειοθεραπεία και την ακτινοθεραπεία, αντίστοιχα. Η επίδραση αυτής της μορφής στρες στους παρακείμενους στον όγκο στρωματικούς ινοβλάστες καθώς επίσης και η αλληλεπίδραση των τελευταίων με τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα δεν έχει διερευνηθεί εκτενώς. Για το σκοπό αυτό, πλήρεις καλλιέργειες ανθρώπινων πνευμονικών στρωματικών ινοβλαστών εκτέθηκαν σε επαναλαμβανόμενες μη-κυτταροτοξικές δόσεις ταξόλης, σισπλατίνης, δοξορουβικίνης και STI571. Παρατηρήσαμε ότι μια και μόνο δόση των δυο γενοτοξικών αντικαρκινικών ενώσεων (δοξορουβικίνη, σισπλατίνη) ενεργοποιεί άμεσα το μηχανισμό απόκρισης σε βλάβες του DNA, όπως είδαμε από την ενεργοποίηση του κλασικού ενδοκυτταρικού μονοπατιού απόκρισης σε βλάβες του DNA , ATM/Chk2/p53/p21CIP1/WAF1. Επίσης παρατηρήσαμε ότι η έκθεση των ινοβλαστών σε επαναλαμβανόμενες μη-κυτταροτοξικές δόσεις σισπλατίνης, δοξορουβικίνης, ταξόλης αλλά όχι και STI571 επάγει πρόωρη κυτταρική γήρανση. Τα κύτταρα αυτά εμφανίζουν όλα τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του γηρασμένου κυττάρου, όπως μορφολογικές αλλαγές, αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, υπερέκφραση των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου p21CIP1/WAF1 και p16INK4A , αύξηση της έκφρασης γονιδίων-δεικτών της κυτταρικής γήρανσης καθώς επίσης και επαγωγή του δείκτη κυτταρικής γήρανσης SA-β-Gal. Βρήκαμε μάλιστα ότι ειδικά στην περίπτωση έκθεσης των κυττάρων σε επαναλαμβανόμενες δόσεις ακτινοβολίας γ η επαγωγή πρόωρης γήρανσης εξαρτάται από την έκφραση της πρωτεΐνης p53. Στη συνέχεια μελετήθηκε ο ρόλος των πρόωρα γηρασμένων από χημειοθεραπευτικές ενώσεις πνευμονικών ινοβλαστών στην ανάπτυξη των ανθρώπινων πνευμονικών καρκινικών κυττάρων Α549. Βρήκαμε ότι το εθισμένο μέσο από νεαρούς και πρόωρα γηρασμένους από τις χημειοθεραπευτικές ενώσεις ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες δεν επηρεάζει σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Παράλληλα κατά τα πειράματα με συγκαλλιέργειες παρατηρήθηκε μικρή διέγερση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων όταν αυτά καλλιεργηθούν παρουσία ινοβλαστών πρόωρα γηρασμένων από δοξορουβικίνη, σισπλατίνη ή ταξόλη. Αντίθετα, από τις in vivo μελέτες σε ανοσοκατασταλμένα ποντίκια παρατηρήσαμε ότι παρουσία των γηρασμένων τόσο από ταξόλη όσο και από δοξορουβικίνη πνευμονικών ινοβλαστών διεγείρεται έντονα η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και σχηματίζονται μεγάλοι συμπαγείς όγκοι και με ένα καλά αναπτυγμένο δίκτυο αιμοφόρων αγγείων. Αποδείξαμε παράλληλα, όσον αφορά στους πρόωρα γηρασμένους από ακτινοβολία γ πνευμονικούς ινοβλάστες, ότι η διέγέρση της ανάπτυξης του όγκου in vivo οφείλεται εν μέρει στην έκκριση μεταλλοπρωτεασών από τα γηρασμένα κύτταρα. Τα παραπάνω αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η επαγωγή πρόωρης κυτταρικής γήρανσης αποτελεί μια σημαντική παρενέργεια της χημειοθεραπείας. Τέλος, επιχειρήσαμε να μελετήσουμε το ρόλο των χημειοθεραπευτικών ενώσεων στη γήρανση και την ικανότητα διαφοροποίησης των ανθρώπινων στελεχιαίων μεσεγχυματικών κυττάρων του μυελού των οστών (hMSC). Στα πλαίσια αυτής της μελέτης παρατηρήσαμε ότι τόσο η σισπλατίνη και η δοξορουβικίνη όσο και η ταξόλη επάγουν πρόωρη γήρανση στα hMSC και επηρεάζουν αρνητικά την ικανότητα των τελευταίων να διαφοροποιούνται προς λιποκύτταρα, οστεοβλάστες και χονδροκύτταρα. Όλα τα παραπάνω στοιχεία συνάδουν με την υπόθεση ότι τόσο η αναπαραγωγική όσο και η πρόωρη κυτταρική γήρανση που επάγεται από στρες επηρεάζουν άμεσα την ιστική ομοιοστασία.