Συστημικές αποκρίσεις μυών Mus musculus σε ηλεκτομαγνητικά πεδία ραδιοσυχνοτήτων

Abstract

It has been postulated that earth after its formation as a planet, 4.6 billion years ago, was exposed to a “shower” of electromagnetic radiation consisting mainly of the solar spectrum (containing mostly similar to currently existing visible light, ultraviolet and infrared radiation), as well as of high-energy cosmic rays. These environmental radiation conditions under which the first organisms were emerged and started their evolution 3.8 billion years ago, changed a few decades after the discovery of the electron by Thomson (1897). Thus, after 1920, the gradual development of wireless technology began, which resulted in the creation of artificial sources of non-ionizing electromagnetic radiation (EMR). This kind of radiation, while propagating in the air, produces the so-called electromagnetic fields (EMF). Particularly important is the radiation spectrum of radio frequencies (RF), which have spread out all regions of the world, ranging from the frequency of 3 kHz (VHF, very high frequencies, the waves of navigation), up to the frequency of 300 GHz (radar waves). This range, specifically the area of microwaves (MW) (300 MHz - 300 GHz) includes the frequencies of mobile telephone and wireless telephone telecommunications (900 - 1900 MHz) studied in this thesis. You cannot see it, taste it or smell it, but EMR is one of the most pervasive environmental pollutants (electrosmog) throughout all countries today. EMR or EMFs are the terms that broadly describe exposures created by a vast array of wired and wireless technologies that have altered the landscape of our lives in countless beneficial but also potentially harmful ways. Although this kind of radiation does not have sufficient energy to break off chemical bonds directly, nevertheless it does so indirectly, through non-thermal processes, possibly involving free radicals’ increase followed by oxidative stress induction. Intense research activity has focused on RF EMFs, because of their association with numerous health symptoms such as headaches, fatigue, dizziness, insomnia, allergies, tachycardia, nervousness, lack of concentration, memory loss, infertility and carcinogenesis, hence the number of publications on the biological effects has increased exponentially since 1985 until today. However, the results of the studies so far are still controversial and the mechanisms of action have not been clarified yet. The announcement of the International Committee of Research on Cancer (International Agency for Research on Cancer - IARC) of the World Health Organization (World Health Organization - WHO), on May 31, 2011, which ranked mobile phones and similar wireless devices as possible carcinogens (category 2B), raised the concern of the scientific community and society, and formally acknowledged for the first time the potential health risks of RF-EMFs. Objectives: This thesis was designed to study the impact of non-ionizing electromagnetic radiation (NI-EMR) emitted by two wireless devices of extensive daily use, the mobile phone and the cordless phone. Because the understanding of biological processes under normal or abnormal conditions is associated with the selection of a suitable model system, we chose in our study a mammalian species, the rodent Mus musculus and particularly the strains Balb/c and C57BL/6J. The time period that this thesis began, there were some reports, mostly controversial, showing involvement of microwave radiation on cognitive dysfunctions, blood-brain barrier disruption, DNA breaks, embryogenesis disorders, apoptosis induction, gene expression changes and brain tumor development increase, but only a few reports were dealing with changes at the protein expression level as revealed by proteomics and mainly on cell cultures. It is also worth-mentioning, that by 2008 all studies were using generators or similar exposure systems rather than typical wireless telephone devices for human use. Moreover, no other study has been published to date with radiation-based wireless phone. In this study, the exposure durations were simulating real-life “human-mode” conditions of usage at intensity/absorbance values far below the safety recommendations of the International Committee for Non ionizing Radiation Protection (ICNIRP), proposed and adopted by WHO on 1998. Our experimental design was based on four approaches: a) detection of osteogenesis’ disorders during pregnancy - histochemical/histological analysis of the skeleton of newborns and of adult mice exposed to EMFs during pregnancy-, b) detection of learning-memory deficits by using behavioral tasks, c) stress response by measuring the blood plasma corticosterone levels and by measuring the total protein oxidation of the erythrocyte membranes (by calculating the protein carbonylation index using the Oxyblot reagent), as well as with behavioral tests and d) analysis of the protein expression in three brain regions (frontal lobe, hippocampus and cerebellum) of adult mice by using the high throughput proteomics technology. a) Osteogenesis disorders during pregnancy. Since the period of gestation is a highly sensitive period to environmental factors, adult female Balb/c mice have been exposed to cell phone radiation for 6 or 30 minutes daily for 21 days (during the whole gestation period) and afterwards, the basicranium, the neurocranium and the thoracic ribs have been examined histologically and histochemically. The effects of radiation were assessed immediately after birth by macroscopical observation of the newborn mice for possible malformations, and also after double histochemical staining of their skeletons with Alcian blue (specific dye for mucopolysaccharides - cartilage) and Alizarin red S (osseous tissue-specific stain). No changes were observed in basicraniun, while low grade osteogenetic lesions have been observed in neurocranium in a large percentage of the exposed animals (60-100% depending on the exposure time) and also Meckelian cartilage displacement in the mandible. In the thoracic ribs, reduced ossification occurred (in the 100% of the exposed animals) and the eighth thoracic rib remained attached to the sternum (in a percentage up to the 30% of the exposed animals). These changes were transient and they were not detected in the animals that were allowed to grow thereafter until weaning. It seems that the migration of neural crest cells and their ability to accurately find their colonization site was not affected, while it is assumed that changes in the composition of the mucopolysaccharides’ metabolism or disorders on the deposition of calcium may took place (Fragopoulou AF, Koussoulakos SL, Margaritis LH, 2010). b) Learning and memory disorders. We used specific behavioral tests, such as the Morris water maze, which examines the spatial memory. During the 4 day-period of the experimental procedure, Balb/c male mice, exposed to cell phone radiation for 2 h/day, were trained to find a submerged platform within a pool by using spatial cues placed on the walls. After the "training phase" and after removing the platform from the water, the mice were left swimming in the pool to remember its position. The exposed animals showed difficulties in transferring the acquired spatial information from day to day and they also exhibited inability to consolidate/revoke the already stored information, incriminating the hippocampus as a possible direct or indirect target of radiation (Fragopoulou AF, Miltiadous P, Stamatakis A, Stylianopoulou F, Koussoulakos SL, Margaritis LH, 2010). In order to test the recognition memory function, we used adult male C57BL6/J mice submitted to the "novel object recognition task" after being exposed for 5 months to wireless DECT phone base radiation (8 and 14 hours per day). During the task, mice were allowed to explore two identical objects and then asked to explore the familiar and a new object inside a square arena. It was found that irradiation disrupted the ability of the animals to recognize the new object and therefore the information storage capacity from the sensory to the entorhinal cortex and to the hippocampus, since these brain regions control this behavioral task. c) Stress induction. Since memory function has been related so far to the stress status of higher organisms, the blood plasma corticosterone levels have been analyzed in the above same mice, at different time points. Increased corticosterone levels have been observed as an acute response to radiation, with subsequent normalization, which is possibly explained by the mobilization of homeostatic mechanisms. The non-chronic "stress-situation" in the exposed animals, cause to the specific type and dose of radiation, was also confirmed by behavioral tests (elevated plus maze and open field). Moreover, since the erythrocytes can be used as body stress indicators, the rate of the carbonylated proteins of the erythrocyte membranes has been studied in the respective days that the corticosterone levels measurements took place. No statistically significant increase in the protein carbonylation index was revealed for the majority of the animals, although an increase in the oxidation of specific proteins has been observed in some individual animals. Our results probably show that the provoked acute stress induction is compensated by the antioxidant capacity of the red blood cells (which, unlike the plasma capacity, is much stronger), but also may indicate that this effect can be individual animal-dependent. d) Protein expression changes. To determine whether the above mentioned behavioral changes are associated with changes in the expression of brain proteins in mice, proteomics analysis has been performed, after 8-month exposure of the animals to mobile phone or wireless DECT phone base radiation under strictly controllable conditions. In this approach, for the first time worldwide, three main regions of the brain were analyzed: the hippocampus, the cerebellum and the frontal lobe; regions involved in cognitive functions. The data revealed that the expression profile of a large number of proteins (143) had changed (overexpression or downregulation) in response to radiation, including brain specific proteins, metabolic, cytoskeletal and heat shock proteins (HSPs) (Fragopoulou AF, Samara A, Antonelou MH, Xanthopoulou A, Papadopoulou A, Vougas K, Koutsogiannopoulou E, Anastasiadou E, Stravopodis DJ, Tsangaris GTh, Margaritis LH, 2012). Specifically: • in the hippocampus, 11 proteins were upregulated, whereas another 11 were downregulated after the animal exposure to a wireless DECT base, compared to the sham-exposed animals. In addition, 37 proteins were found upregulated and 33 downregulated after the exposure of the animals to a mobile phone compared to the sham-exposed; • in the frontal lobe, 12 proteins were upregulated and 11 proteins were downregulated after exposure of the animals to a wireless base. The mobile phone exposure caused 19 proteins to become upregulated and 18 proteins downregulated; • in the cerebellum, 8 proteins were upregulated and 10 proteins were downregulated after exposure of the animals to a wireless base, whereas 36 proteins were upregulated, and 18 proteins were downregulated in the mobile phone exposed animal group. The greatest effect seems to be on the hippocampus, probably cause to the existence of SAR hot spots, and even after exposure to cell phone radiation, which can be explained by the higher emission intensity. From all the proteins that their expression has changed after exposure to wireless phone radiation in mice, we note the brain specific proteins, like synapsin, syntaxin, synaptotagmin, dynamin, dynactin, drebrin, neurofilaments, alpha synuclein, apolipoprotein E (apoE), and also the glial filament acidic protein (GFAP) and the glial maturation factor (GMF), changes which could possibly explain the memory impairment and the stress induction that we have observed in our experiments, but also the brain tumor development (glioma) that has been associated in epidemiological studies, with chronic (at least ten years) 'heavy' use of mobile and wireless phones. The proteins apoE, GFAP and GMF were selected for further analysis by western blot and the change in their expression has been confirmed. It is worth-mentioning that proteomics analysis of mouse hippocampus, but after short-term exposure to wireless DECT telephone base, has shown changes in the expression of several proteins, but no statistically significant change in the expression of GFAP (biomarker for neurotoxicity and glioma) or GMF (intracellular transduction regulator in astrocytes and regulator of tumor cell proliferation). This fact reinforces the view that any possible involvement of EMR in the carcinogenesis development can only be possible after chronic exposure. Although, it is not yet known through which pathways the levels of these proteins in these specific brain regions change their expression, it is speculated that the initial potential damage must be focused on oxidative stress dragging indirectly heat shock protein activity, apoptosis induction, impaired function of synapses and brain plasticity alterations. In conclusion, this thesis reveals significant effects of RF-EMFs on the mammal Mus musculus, such as memory disorders, stress induction and brain protein expression changes. These disorders are thought to be related to commonly reported symptoms (aggressiveness, irritability, memory loss, headaches, insomnia, fatigue, development of brain tumors after long-term exposure). Further research should be performed to elucidate the mechanism of the initial impact of EMR, and the effect of several dosimetry parameters, like the exposure time, the modulation frequency and the intensity of radiation in the same animal, but also in other experimental models.

Όπως εκτιμάται από ειδικούς επιστήμονες, η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που «έλουζε» τη γη μετά τη δημιουργία της 4,6 δισεκατομμύρια χρόνια πριν, περιελάμβανε κυρίως το φάσμα από τον ήλιο (υπέρυθρο, ορατό και υπεριώδες), καθώς και την κοσμική ακτινοβολία υψηλής ενέργειας. Σε αυτές τις συνθήκες φυσικής ακτινοβολίας αναπτύχθηκαν οι πρώτοι οργανισμοί πριν από 3,8 δισεκατομμύρια χρόνια και συνέχισαν να υπάρχουν μέχρι σήμερα με διάφορες παραλλαγές (εξάρσεις ηλιακών κηλίδων, κλπ.). Μερικές δεκαετίες μετά την ανακάλυψη του ηλεκτρονίου από τον Thomson (1897) ξεκίνησε σταδιακά η ανάπτυξη της ασύρματης τεχνολογίας, η οποία είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία τεχνητών πηγών μη ιονιζουσών ακτινοβολιών που διαδιδόμενες στο χώρο παράγουν τα λεγόμενα ηλεκτρομαγνητικά πεδία (ΗΜΠ). Ιδιαίτερα σημαντικές είναι οι ακτινοβολίες που εντάσσονται στο φάσμα των ραδιοσυχνοτήτων, που έχουν κατακλύσει όλες τις περιοχές του πλανήτη και κυμαίνονται από τη συχνότητα των 3 χιλιοκύκλων/sec (kHz) (τα υπερμακρά κύματα της ναυσιπλοΐας), μέχρι τη συχνότητα των 300 γιγακύκλων/sec (GHz) (τα κύματα των ραντάρ). Στο φάσμα αυτό, και συγκεκριμένα στην περιοχή των μικροκυμάτων (300 MHz - 300 GHz) ανήκουν και οι συχνότητες της κινητής τηλεφωνίας και του ασύρματου τηλεφώνου (900 - 1900 MHz) που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Τα ΗΜΠ ραδιοσυχνοτήτων έχουν αποτελέσει αντικείμενο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας λόγω της συσχέτισής τους με πληθώρα συμπτωμάτων στην υγεία, όπως πονοκέφαλοι, κόπωση, ίλιγγοι, αϋπνίες, αλλεργίες, ταχυκαρδία, νευρικότητα, έλλειψη συγκέντρωσης, απώλεια μνήμης, υπογονιμότητα και καρκινογένεση, γι’ αυτό και ο αριθμός δημοσιεύσεων όσον αφορά στις βιολογικές επιπτώσεις παρουσιάζει εκθετική αύξηση από το 1985 έως και σήμερα. Εντούτοις, τα αποτελέσματα των μελετών παραμένουν μέχρι στιγμής αντικρουόμενα και οι μηχανισμοί δράσης δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Η ανακοίνωση της 31ης Μαΐου 2011 της Διεθνούς Επιτροπής της Έρευνας για τον Καρκίνο (International Agency for Research on Cancer - IARC) του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (World Health Organization - WHO), που κατέταξε τα κινητά τηλέφωνα και παρόμοιες ασύρματες συσκευές ως πιθανά καρκινογόνα (κατηγορία 2Β), τάραξε τα νερά της επιστημονικής κοινότητας και της κοινωνίας, καθώς αναγνώρισε για πρώτη φορά επίσημα την πιθανή επικινδυνότητα της ακτινοβολίας αυτής για την υγεία. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως αντικείμενο τη μελέτη των επιπτώσεων της μη ιονίζουσας ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (ΗΜΑ) εκπεμπόμενης από δύο ευρείας καθημερινής χρήσης συσκευές ασύρματης τεχνολογίας, το κινητό τηλέφωνο και το ασύρματο τηλέφωνο. Επειδή η κατανόηση των βιολογικών διεργασιών κάτω από φυσιολογικές ή μη φυσιολογικές συνθήκες σχετίζεται με την επιλογή του κατάλληλου πρότυπου συστήματος, στη δική μας μελέτη χρησιμοποιήσαμε το θηλαστικό Mus musculus και συγκεκριμένα τα στελέχη Balb/c και C57BL/6J. Την περίοδο που ξεκίνησε η εν λόγω διατριβή υπήρχαν αρκετές αναφορές για εμπλοκή της μικροκυματικής ακτινοβολίας σε γνωστικές δυσλειτουργίες, τρωκτικών, στη διαταραχή του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, σε θραύσεις DNA, σε εμβρυογεννητικές αλλοιώσεις, στην επαγωγή απόπτωσης, στις αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και στην πιθανότητα εμφάνισης εγκεφαλικών όγκων, αλλά με αντικρουόμενα και διάσπαρτα αποτελέσματα. Ελάχιστες ήταν δε οι μελέτες με προσέγγιση πρωτεωμικής που καταδείκνυαν επίδραση στην πρωτεϊνική έκφραση και κυρίως σε κυτταροκαλλιέργειες. Να σημειωθεί επιπλέον, ότι όλες οι έρευνες μέχρι το 2008 περιελάμβαναν χρήση γεννητριών ή ανάλογων συστημάτων και όχι τυπικές συσκευές ασύρματης τηλεφωνίας ανθρώπινης χρήσης. Επιπλέον, καμία άλλη μελέτη δεν έχει μέχρι σήμερα δημοσιευθεί με ακτινοβολία βάσης ασύρματου τηλεφώνου. Στόχοι της Διατριβής: Στη διατριβή αυτή προσομοιάστηκαν διάρκειες έκθεσης ανθρώπινης χρήσης των ανωτέρω συσκευών ώστε να εφαρμοστούν σε μυς και ο πειραματικός σχεδιασμός βασίστηκε σε τέσσερις προσεγγίσεις: α) ανίχνευση διαταραχών οστεογένεσης κατά την κύηση – ιστοχημική/ιστολογική ανάλυση σκελετού νεογέννητων και ενήλικων ατόμων που εκτέθηκαν σε ΗΜΠ κατά τη διάρκεια της κύησης, β) ανίχνευση διαταραχών μάθησης - μνήμης με συμπεριφορικές δοκιμασίες, γ) απόκριση στο στρες με ανάλυση των επιπέδων κορτικοστερόνης στο πλάσμα του αίματος και ανίχνευση οξείδωσης σε πρωτεΐνες της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης (μέτρηση του δείκτη καρβονυλίωσης με το αντιδραστήριο Oxyblot), καθώς επίσης και με δοκιμασίες συμπεριφοράς και δ) ανάλυση πρωτεϊνικής έκφρασης περιοχών του εγκεφάλου (μετωπιαίου φλοιού, ιππόκαμπου και παρεγκεφαλίδας) ενήλικων μυών με πρωτεωμική τεχνολογία. α) Διαταραχές οστεογένεσης κατά την κύηση. Δεδομένου ότι η περίοδος της κύησης είναι μια περίοδος ευαίσθητη στην επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων, ενήλικοι θηλυκοί μύες Balb/c εκτέθηκαν σε ακτινοβολία κινητού τηλεφώνου για 6 ή 30 λεπτά ημερησίως για 21 ημέρες και ακολούθως μελετήθηκαν ιστοχημικά-ιστολογικά το βασικρανίο, το νευροκρανίο και οι πλευρές του θωρακικού κλωβού. Οι επιπτώσεις της ακτινοβολίας εκτιμήθηκαν αμέσως μετά τη γέννηση με μακροσκοπική παρατήρηση των νεογέννητων μυών για έλεγχο εμφάνισης πιθανών δυσπλασιών, καθώς και ύστερα από διπλή ιστοχημική χρώση των σκελετών τους με Alcian blue (χρωματίζει βλεννοπολυσακχαρίτες - χόνδρο) και Alizarin red S (χρωματίζει οστίτη ιστό). Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στο βασικρανίο, ενώ αντίθετα διαπιστώθηκαν σε μεγάλο ποσοστό των εκτεθειμένων ζώων (60-100% ανάλογα με το χρόνο έκθεσης) μικρού βαθμού οστεογεννητικές αλλοιώσεις στο νευροκρανίο και μετακίνηση του χόνδρου του Meckel στην κάτω γνάθο. Στις θωρακικές πλευρές παρατηρήθηκε μειωμένη οστεοποίηση (σε ποσοστό 100% των εκτεθειμένων ζώων) και η 8η θωρακική πλευρά να προσκολλάται στο στέρνο (σε ποσοστό έως 30% των εκτεθειμένων ζώων). Οι αλλοιώσεις αυτές ήταν παροδικές και δεν ανιχνεύτηκαν στα άτομα που αφέθηκαν να μεγαλώσουν στη συνέχεια μέχρι τον απογαλακτισμό. Φαίνεται πως δεν επηρεάστηκε η μετανάστευση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας και η ικανότητά τους να ευρίσκουν επακριβώς την περιοχή εποίκισης, ενώ πιθανολογείται τροποποίηση του μεταβολισμού στη σύνθεση βλεννοπολυσακχαριτών ή διαταραχή στην εναπόθεση του ασβεστίου (Fragopoulou AF, Koussoulakos SL, Margaritis LH, 2010). β) Συμπεριφορικές διαταραχές μάθησης-μνήμης . Χρησιμοποιήσαμε ειδικές δοκιμασίες χωρικής και μη χωρικής μνήμης, όπως είναι ο υδάτινος λαβύρινθος κατά Morris (Morris water maze, MWM) και η δοκιμασία αναγνώρισης καινοφανούς αντικειμένου (Novel Object Recognition task, NOR) αντίστοιχα. Κατά τη διάρκεια των 4 ημερών της πρώτης δοκιμασίας αρσενικοί μύες Balb/c που εκτέθηκαν σε ακτινοβολία κινητού τηλεφώνου για 2 ώρες ημερησίως, εκπαιδεύτηκαν να βρίσκουν μια πλατφόρμα λίγο κάτω από την επιφάνεια του νερού εντός μιας δεξαμενής βάσει σημαδιών στο χώρο. Μετά τη «φάση εκπαίδευσης» και αφού αφαιρέθηκε η πλατφόρμα από το νερό, οι μύες αφέθηκαν να θυμηθούν τη θέση αυτής. Τα ακτινοβολημένα ζώα παρουσίασαν δυσκολία στη μεταφορά της χωρικής προσκτηθείσας πληροφορίας από ημέρα σε μέρα, καθώς και αδυναμία παγίωσης/ανάκλησης της ήδη αποθηκευμένης πληροφορίας, ενοχοποιώντας τον ιππόκαμπο ως πιθανό στόχο της ακτινοβολίας άμεσα ή έμμεσα (Fragopoulou AF, Miltiadous P, Stamatakis A, Stylianopoulou F, Koussoulakos SL, Margaritis LH, 2010). Για τον έλεγχο της μη χωρικής μνήμης (και συγκεκριμένα της μνήμης αναγνώρισης), αρσενικοί ενήλικοι μύες C57BL6/J, υποβλήθηκαν, έπειτα από 5μηνη έκθεση σε ακτινοβολία βάσης ασύρματου τηλεφώνου, στην εν λόγω δοκιμασία (NOR), κατά την οποία αρχικά αφέθηκαν να εξερευνήσουν δύο πανομοιότυπα αντικείμενα και ακολούθως καλέστηκαν να «διακρίνουν» το γνώριμο από ένα καινούργιο. Διαπιστώθηκε πως η ακτινοβόληση διατάραξε την ικανότητα αναγνώρισης του νέου αντικειμένου και συνεπώς την ικανότητα απομνημόνευσης των πληροφοριών από τα αισθητήρια στον ενδορρινικό φλοιό και τον ιππόκαμπο, που ελέγχουν τη συγκεκριμένη δοκιμασία. γ) Επαγωγή στρες. Επειδή η λειτουργία της μνήμης σχετίζεται με την κατάσταση άγχους των ανώτερων οργανισμών, αναλύθηκαν τα επίπεδα κορτικοστερόνης στο πλάσμα του αίματος των ίδιων μυών σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα κατά την πορεία της ακτινοβόλησης και διαπιστώθηκε αύξηση ως άμεση απόκριση στην ακτινοβολία, με επακόλουθη εξομάλυνση, που ενδεχόμενα οφείλεται στην επιστράτευση ομοιοστατικών μηχανισμών. Η μη πρόκληση χρόνιας κατάστασης «άγχους» στα ζώα, εξαιτίας της ακτινοβόλησης, επιβεβαιώθηκε και με δοκιμασίες συμπεριφοράς, τον υπερυψωμένο λαβύρινθο σχήματος σταυρού και το ανοιχτό πεδίο. Επιπλέον, επειδή τα ερυθροκύτταρα θεωρούνται ως δείκτες στρες ενός οργανισμού, μελετήθηκε το ποσοστό των καρβονυλιωμένων πρωτεϊνών των μεμβρανών τους στις αντίστοιχες ημέρες που μελετήθηκαν και τα επίπεδα της κορτικοστερόνης στο πλάσμα του αίματος. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση στα επίπεδα καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών στο σύνολο των ζώων, παρόλο που σε μεμονωμένα ζώα διαπιστώθηκε μια μικρή αύξηση του βαθμού οξείδωσης σε κάποιες πρωτεΐνες κατά την 1η ημέρα της έκθεσης. Τα αποτελέσματά μας πιθανά υποδηλώνουν πως η όποια αύξηση στρες επήλθε στον οργανισμό εξαιτίας της ακτινοβολίας, εξουδετερώθηκε επιτυχώς από την αντιοξειδωτική ικανότητα των ερυθροκυττάρων στα περισσότερα ζώα, η οποία, σε αντίθεση με εκείνη του πλάσματος, είναι πολύ πιο ισχυρή. Όμως, επιπλέον, τα αποτελέσματά μας δηλώνουν πως η απάντηση στο στρες πιθανά είναι άτομο-εξαρτώμενη διαδικασία και ο κάθε οργανισμός μπορεί να το καταστείλει σε διαφορετικό βαθμό. δ) Διαταραχή στην έκφραση πρωτεϊνών του εγκεφάλου. Για να διαπιστωθεί εάν οι παραπάνω αλλαγές συμπεριφοράς σχετίζονται με τροποποιήσεις στην έκφραση των πρωτεϊνών στο εγκέφαλο των μυών, πραγματοποιήθηκε, έπειτα από 8μηνη έκθεση σε ακτινοβολία κινητού ή ασύρματου τηλεφώνου, πρωτεωμική ανάλυση σε τρεις περιοχές του εγκεφάλου μυών (για πρώτη φορά διεθνώς), του ιππόκαμπου, της παρεγκεφαλίδας και του μετωπιαίου λοβού, περιοχές που εμπλέκονται σε γνωστικές λειτουργίες. Η προσέγγιση αυτή έδειξε πως μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών (143) παρουσιάζει τροποποίηση στα προφίλ έκφρασης αυτών (υπερέκφραση ή μειορύθμιση) σε απόκριση στην ακτινοβολία, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών που σχετίζονται με το νευρικό σύστημα και τον μεταβολισμό, καθώς και κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες και πρωτεΐνες θερμικού πλήγματος (HSPs) (Fragopoulou AF, Samara A, Antonelou MH, Xanthopoulou A, Papadopoulou A, Vougas K, Koutsogiannopoulou E, Anastasiadou E, Stravopodis DJ, Tsangaris GTh, Margaritis LH, 2012). Συγκεκριμένα: • στον ιππόκαμπο, υπερεκφράζονται 11 πρωτεΐνες έπειτα από έκθεση σε βάση ασύρματου τηλεφώνου και 37 έπειτα από έκθεση σε κινητό τηλέφωνο, ενώ μειορυθμίζονται 11 και 33 αντίστοιχα • στην παρεγκεφαλίδα, υπερεκφράζονται 12 πρωτεΐνες έπειτα από έκθεση σε βάση ασύρματου τηλεφώνου και 19 έπειτα από έκθεση σε κινητό τηλέφωνο, ενώ μειορυθμίζονται 11 και 18 αντίστοιχα • στον μετωπιαίο φλοιό, υπερεκφράζονται 8 πρωτεΐνες έπειτα από έκθεση σε βάση ασύρματου τηλεφώνου και 36 έπειτα από έκθεση σε κινητό τηλέφωνο, ενώ μειορυθμίζονται 10 και 18 αντίστοιχα. Διαπιστώθηκε πως τη μεγαλύτερη επίδραση ακτινοβολίας την υφίσταται ο ιππόκαμπος πιθανά λόγω ύπαρξης «θερμών εστιών» (hot spots) και μάλιστα έπειτα από έκθεση από κινητό τηλέφωνο, ίσως επειδή η εκπεμπόμενη ισχύς είναι μεγαλύτερη (12 V/m έναντι 2.7 V/m). Από όλες τις πρωτεΐνες που άλλαξε η έκφρασή τους μετά από έκθεση μυών στην ακτινοβολία σημειώνουμε τις νευροειδικές: συναψίνη, συνταξίνη, συναπτοταγμίνη, δυναμίνη, δυνακτίνη, δρεβρίνη, νευροϊνίδια, άλφα συνουκλεΐνη, απολιποπρωτεΐνη E (apoE), καθώς και την όξινη ινιδιακή πρωτεΐνη της γλοίας (GFAP) και τον παράγοντα ωρίμανσης της γλοίας (GMF), που θα μπορούσαν πιθανά να εξηγήσουν τις διαταραχές μνήμης και την επαγωγή στρες που παρατηρήσαμε στα πειράματά μας, αλλά και την ανάπτυξη όγκων (γλοιώματος) που έχει συσχετιστεί, στις επιδημιολογικές μελέτες, με τη μακροχρόνια (τουλάχιστον δεκαετή) «βαριά» χρήση κινητών και ασύρματων τηλεφώνων. Οι πρωτεΐνες apoE, GFAP και GMF επελέγησαν για περαιτέρω ανάλυση ανοσοστυπώματος κατά western και επιβεβαιώθηκε η αλλαγή στην έκφρασή τους. Να σημειωθεί ότι πρωτεωμική ανάλυση του ιππόκαμπου μυών έπειτα από μικρής διάρκειας έκθεσή τους σε ΗΜΑ βάσης ασύρματου τηλεφώνου, έδειξε επίσης αλλαγή στην έκφραση αρκετών πρωτεϊνών, όχι όμως στατιστικά σημαντική αλλαγή στην έκφραση της GFAP (βιοδείκτης για νευροτοξικότητα και γλοίωμα) και της GMF (ενδοκυττάριος ρυθμιστής μεταγωγής σήματος στα αστροκύτταρα και ρυθμιστής παύσης πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων), γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι η πιθανή εμπλοκή της ΗΜΑ στην έναρξη ή επιδείνωση καρκινογένεσης μπορεί να προέλθει πιθανά μόνο έπειτα από χρόνια έκθεση. Αν και δεν είναι ακόμα γνωστό μέσω ποιών μονοπατιών αλλάζουν τα επίπεδα των πρωτεϊνών αυτών στις συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου, πιθανολογείται πως η αρχική βλάβη ενδεχόμενα εστιάζεται στο οξειδωτικό στρες συμπαρασύροντας έμμεση δράση πρωτεϊνών θερμικού πλήγματος, απόπτωση και διαταραχή της λειτουργίας των συνάψεων. Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή αποκαλύπτει σημαντικές επιδράσεις των ηλεκτρομαγνητικών πεδίων (ΗΜΠ) ραδιοσυχνοτήτων στο θηλαστικό Mus musculus όπως διαταραχές μνήμης, επαγωγή στρες και αλλαγές στην έκφραση πρωτεϊνών του εγκεφάλου. Οι διαταραχές αυτές πιθανά να σχετίζονται με συχνά αναφερόμενα συμπτώματα (επιθετικότητα, νευρικότητα, απώλεια μνήμης, πονοκέφαλος, αϋπνία, κόπωση, ανάπτυξη εγκεφαλικών όγκων έπειτα από μακρόχρονη έκθεση). Περαιτέρω έρευνα πρέπει να πραγματοποιηθεί για τη διαλεύκανση του μηχανισμού αρχικής επίδρασης της ΗΜΑ, καθώς και για την επίδραση της διάρκειας έκθεσης, της διαμόρφωσης, της συχνότητας και έντασης της ακτινοβολίας στο ίδιο ζωικό πρότυπο, αλλά και σε άλλα πειραματικά μοντέλα.