Μελέτη της επίδρασης του εξωτερικού περιβάλλοντος στη γονιδιακή έκφραση και λειτουργία κυττάρων μεσοσπονδύλιου δίσκου

Abstract

Aim. The aim of this thesis was to investigate the effects of the microenvironmental conditions of the intervertebral disc (i.e. absence of serum, reduced glucose concentrations, increased osmolality and hypoxia) a. to the gene expression and function of the nucleus pulposus cells, after exposure to oxidative stress, under culture conditions that simulate those of the tissue, and b. to the characteristic inflammatory and catabolic phenotype of senescent cells. Aim of this thesis was also to study the effect of known senolytic and senomorphic compounds on the senescent nucleus pulposus cells of the intervertebral disc. Materials and methods. In the present study, primary cultures of young and senescent nucleus pulposus cells of the intervertebral disc were developed. In particular, the effect of the parameters that make up the conditions of the microenvironment of the tissue, namely absence of serum, reduced glucose concentrations, increased osmolality and hypoxia (IVD conditions), in relation to classic cell culture conditions, was examined concerning the cellular response to oxidative stress. In addition, the parameter of three-dimensional cell cultures in alginate beads, a condition that more closely resembles the extracellular environment conditions compared to classical two-dimensional cultures was studied. Cytotoxicity was assesed by MTT assay, the levels of intracellular reactive oxygen species were determined by the DCFH-DA assay, whereas activation of stress response signaling pathways was studied by Western blot analysis. Cellular senescence was induced by exposure of cells to ionizing radiation. The phenotype of young and senescent cells, in the classic conditions and conditions that simulate those of the intervertebral disc, was conducted as follows: Real-time quantitative PCR was used to determine the levels of gene expression of protein markers of cellular senescence, p16WAF1 and p21INKA4, but also these of important proteins of the inflammatory and catabolic phenotype of senescent cells under classic and IVD conditions. In addition to the increased expression of these protein markers, the senescent phenotype of these cells was in every case confirmed by using SA-β-Gal incorporation and BrdU nuclear staining in the conditions studied. At the same time, by using FRET assay and zymography, both total and active protein levels of important metalloproteinases for the degeneration of the disc (ie MMP-1, -2 and -3) were examined, in classic and IVD conditions. Finally, the cytotoxicity detection methods of MTT assay and large-scale Neutral Red assay were used for the possible detection of new senolytic compounds in the well characterized system of young and senescent bovine cells. Results. In the present thesis it was found that the nucleus pulposus cells exhibit similar resistance to the effect of hydrogen peroxide on all parameters of the microenvironment of the intervertebral disc examined, in both two-dimensional and three-dimensional cell cultures. In addition, they exhibit similar patterns of activation of known stress response signaling pathways following oxidative stress, in classic two-dimensional cell culture conditions and three-dimensional cell culture conditions. Additionally, in the present work, senescent nucleus pulposus cells were developed, in which expression of classic markers of cellular senescence was detected, along with the characteristic of the senescence associated secretory phenotype (SASP). At the same time, it has been found that both these markers of cellular senescence and the characteristic SASP phenotype of senescent cells are maintained in the classic culture conditions and in conditions that simulate those of the intervertebral disc. Finally, sulforaphane, a known Nrf2 inducer with anti-cancer properties, was detected as a compound with potential senolytic activity for nucleus pulposus cells of bovine intervertebral disc. Conclusions. The main conclusion of this thesis is that the viability and the activation of stress response pathways in nucleus pulposus intervertebral disc cells following oxidative stress, as well as the characteristic catabolic and inflammatory phenotype of senescent cells remain unaffected by the conditions that characterize the intervertebral disc microenvironment. This allows the generalization of the results on cellular senescence that already exist for disk cells in classic cell culture conditions. Also, in this thesis, sulforaphane was detected as a new potential senolytic compound for the cells of bovine intervertebral disc. Accordingly, the cellular system developed can be used as a tool for detecting compounds with potential senolytic or senorphic action, but also for identifying the molecular mechanisms underlying these actions.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των συνθηκών του μικροπεριβάλλοντος του μεσοσπονδύλιου δίσκου (δηλαδή συνθήκες απουσίας ορρού, μειωμένης συγκέντρωσης γλυκόζης, αυξημένης ωσμωμοριακότητας και υποξίας) α. στη λειτουργία και την γονιδιακή έκφραση των κυττάρων πηκτοειδούς πυρήνα, έπειτα από την επίδραση οξειδωτικού στρες, στις συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του ιστού και β. στο χαρακτηριστικό φλεγμονώδη και καταβολικό φαινότυπο των γηρασμένων κυττάρων. Επίσης, σκοπό αποτέλεσε επίσης και η μελέτη της επίδρασης γνωστών σενολυτικών και σενομορφικών ενώσεων, στα γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα μεσοσπονδύλιου δίσκου. Υλικά και μέθοδος. Στη παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες νεαρών και γηρασμένων κυττάρων του πηκτοειδούς πυρήνα μεσοσπονδύλιου δίσκου. Συγκεκριμένα, έγινε η μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων που συνθέτουν τις συνθήκες του μικροπεριβάλλοντος του ιστού, δηλαδή των συνθηκών απουσίας ορρού, μειωμένης συγκέντρωσης γλυκόζης, αυξημένης ωσμωμοριακότητας και υποξία (IVD συνθήκες), σε σχέση με τις κλασικές συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων, όσον αφορά την απόκριση των κυττάρων στο οξειδωτικό στρες. Επιπλέον, μελετήθηκε η παράμετρος τριδιάστατων κυτταροκαλλιεργειών σε σφαιρίδια αλγινικού οξέος σε σχέση με τις κλασικές διδιάστατες καλλιέργειες, μια συνθήκη που προσομοιάζει πιστότερα τις συνθήκες διαβίωσης των κυττάρων στον ιστό in vivo. Η μελέτη της κυτταροτοξικότητας έγινε με τη μέθοδο ΜΤΤ, τα επίπεδα ενδοκυτταρικών ενεργών μορφών οξυγόνου προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο DCFH-DA, ενώ η ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε στρες μελετήθηκε με ανάλυση Western. Για την επαγωγή κυτταρικής γήρανσης χρησιμοποιήθηκε η έκθεση των κυττάρων σε ιονίζουσα ακτινοβολία. Ο φαινότυπος νεαρών και γηρασμένων κυττάρων, σε κλασικές συνθήκες και σε συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου, έγινε ως εξής: Με τη μέθοδο ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου προσδιορίστηκαν, σε κλασικές και συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου, τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης των πρωτεϊνικών δεικτών της κυτταρικής γήρανσης, p16WAF1 και p21INKA4, αλλά και σημαντικών πρωτεϊνικών εκπροσώπων του φλεγμονώδους και καταβολικού φαινοτύπου των γηρασμένων κυττάρων. Εκτός της αυξημένης έκφρασης των συγκεκριμένων πρωτεϊνικών δεικτών, ο γηρασμένος αυτός φαινότυπος των κυττάρων αυτών πιστοποιήθηκε σε κάθε περίπτωση με τις μεθόδους ενσωμάτωσης SA-β-Gal και πυρηνικής χρώσης BrdU στις συνθήκες που μελετήθηκαν. Παράλληλα, με μεθόδους ανάλυσης FRET και ενζυμογραφίας, εξετάστηκαν τα συνολικά αλλά και τα ενεργά επίπεδα των σημαντικών κατά την εκφύλιση του δίσκου μεταλλοπρωτεασών MMP-1, -2 και -3, ανάμεσα σε κλασικές και στις συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου.Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι εκτίμησης κυτταροτοξικότητας, δοκιμασίας ΜΤΤ και Neutral Red ευρείας κλίμακας για την πιθανή ανίχνευση νέων σενολυτικών ενώσεων στο καλά χαρακτηρισμένο σύστημα νεαρών και γηρασμένων βόειων κυττάρων. Αποτελέσματα. Στη παρούσα διδακτορική διατριβή διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα παρουσιάζουν παρόμοια ανθεκτικότητα στην επίδραση υπεροξειδίου του υδρογόνου, σε όλες τις παραμέτρους των IVD συνθηκών που εξετάστηκαν, τόσο σε διδιάστατες όσο και σε τριδιάστατες καλλιέργειες κυττάρων. Ακόμα, επιδεικνύουν παρόμοια πρότυπα ενεργοποίησης γνωστών σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε στρες έπειτα από επίδραση του οξειδωτικού παράγοντα, σε κλασικές διδιάστατες συνθήκες καλλιέργειας και τριδιάστατες καλλιέργειες κυττάρων σε συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Επίσης, στη παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν καλά χαρακτηρισμένα γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα, στα οποία ανιχνεύθηκε η έκφραση κλασικών δεικτών κυτταρικής γήρανσης, μαζί με τον χαρακτηριστικό για τα γηρασμένα κύτταρα εκκριτικό φαινότυπο SASP. Παράλληλα, διαπιστώθηκε ότι τόσο αυτοί οι δείκτες κυτταρικής γήρανσης όσο και ο χαρακτηριστικός καταβολικός και φλεγμονώδης φαινότυπος (SASP) των γηρασμένων κυττάρων διατηρούνται, από τις κλασικές συνθήκες καλλιέργειας και στις συνθήκες που προσομοιάζουν αυτές του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Τέλος, ανιχνεύθηκε η ένωση σουλφοραφάνη ως μια ένωση με πιθανή σενολυτική δράση για τα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα βόειου μεσοσπονδύλιου δίσκου. Συμπεράσματα. Το βασικό συμπέρασμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ότι η βιωσιμότητα και η ικανότητα ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε στρες των κυττάρων πηκτοειδούς πυρήνα μεσοσπονδύλιου δίσκου απέναντι στο οξειδωτικό στρες, αλλά και ο χαρακτηριστικός καταβολικός και φλεγμονώδης φαινότυπος των γηρασμένων κυττάρων, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστοι από τις συνθήκες που χαρακτηρίζουν το μικροπεριβάλλον του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Αυτό επιτρέπει τη γενίκευση αποτελεσμάτων κυτταρικής γήρανσης που ήδη υπάρχουν σε κύτταρα δίσκου, σε κλασικές συνθήκες καλλιέργειας και σε αυτές του ιδιαίτερου περιβάλλοντος του ιστού. Επίσης, στη παρούσα διδακτορική διατριβή ανιχνεύθηκε η ένωση σουλφοραφάνη ως μια νέα πιθανή σενολυτική ένωση για τα κύτταρα βόειου μεσοσπονδύλιου δίσκου. Τέλος, το κυτταρικό σύστημα που αναπτύχθηκε μπορεί να αποτελέσει εργαλείο για την ανίχνευση περισσότερων ενώσεων με πιθανή σενολυτική ή σενομορφική δράση, αλλά και για την εξεύρεση των μοριακών μηχανισμών με τους οποίους επιτελούνται οι δράσεις αυτές.