Οξειδωτικά ένζυμα ελιάς και ελαιολάδου: αλληλεπίδραση με αντιοξειδωτικά

Abstract

Olive oil is one of the oldest known vegetable oils. It is a product with major importance for the diet and the economy of Greece. One of its most important quality problems is oxidative rancidity due the oxidation of compounds and formation of new compounds. In this thesis a study of oxidative enzyme, peroxidase, of virgin olive oil and mature olive fruits, from which the oil is produced, is presented. Oxidative enzyme activities be transferred in virgin olive oil during the olive extraction process and thus they could affect the quality of the oil during storage. In this respect a partial characterization of peroxidase (POD) activity in greek oil producing olives (Olea europea, koroneiki variety) has been undertaken and the presence of this enzyme activity in virgin olive oil samples was confirmed. Active POD extracts were obtained using insoluble poly(vinylpyrrolidone) in 50 mM phosphate, pH 6.0 and further purified by ammonium sulphate fractionation and Sephacryl gel permeation chromatography. Olive fruit POD showed a molecular mass of 44 ± 1.4 kDa. SDS-PAGE analysis of the gel filtration peaks showing POD activity under reducing conditions revealed that the low MW POD activity peak shows a major protein band of 43.7 kDa suggesting that POD studied in the present thesis is composed by a single polypeptide chain. POD of olives expressed catalytic activity with ABTS (2,2΄-azino-bis (3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid)), DMPD (N,N-dimethyl-p-phenylenediamine) and some phenolic substrates of olives and olive oils (protocatechuic, gallic and caffeic acid). However the enzyme was found ineffective with oleuropein, the major polyphenol of olives, as well as with coumaric, ferulic, ascorbic p-hydroxy benzoic acid (monophenolic substarates). pH optimum of the peroxidase-catalyzed oxidation was depended on the substrate used and it was varied from 4.0 to 6.0. The enzyme retained full activity when stored for 1-2 months at -18 oC in presence of glycerol 50% (v/v). For each substrate examined, Km and Vmax values have been determined. Accordingly, we observed that the efficiency of olives POD catalysis depends strongly on the chemical nature of the substrate oxidized. From the Arrhenius plot, the activation energy was estimated 37.9 kJ / mol. Activity assays at different temperature, 30- 60 oC, indicated a significant catalytic efficiency of the enzyme. Olive peroxidase shows significant thermal stability. The addition of SDS decreased the peroxidase activity of olives, therefore olive peroxidase is probably present in a soluble form. Moreover, we found that oleuropein, 4-methyl catechol and SDS drastically inhibited ABTS peroxidation by the olives POD preparation with an IC50 value of 47 μM 22 and 218 μM, respectively. Oleuropein is the bitter secoiridoid polyphenolic glucoside acts as free radical scavenger and inhibits free radical production. Sample of virgin olive oils have been also examined for the presence of proteins and peroxidase activity. The peroxidase activity corresponds to molecules with protein nature, as releaved by experiments of thermal inactivation and proteolysis. ........................

Το ελαιόλαδο είναι ένα από τα αρχαιότερα φυτικά έλαια και αποτελεί ένα προϊόν με μέγιστη σημασία στη διατροφή και στην οικονομία της Ελλάδας. Το σημαντικότερο ίσως πρόβλημα της ποιότητας του είναι το οξειδωτικό τάγγισμα που οφείλεται στην οξείδωση κάποιων από τα συστατικά του και οδηγεί στο σχηματισμό νέων ανεπιθύμητων ενώσεων. Στην παρούσα διατριβή έγινε μελέτη του οξειδωτικού ενζύμου, υπεροξειδάση, σε ελαιοκάρπους, που αποτελούν την πρώτη ύλη παραγωγής του ελαιολάδου, και στο ίδιο το ελαιόλαδο. Οι δραστικότητες των οξειδωτικών ενζύμων, οι οποίες μπορούν να μεταφερθούν στο παρθένο ελαιόλαδο κατά την παραλαβή του από τους ελαιοκάρπους μπορούν να επηρεάσουν δραστικά την ποιότητα του παρθένου ελαιολάδου κατά την αποθήκευσή του. Γι αυτό το λόγο πραγματοποιήθηκε καθαρισμός του ενζύμου υπεροξειδάση και στη συνέχεια μερικός χαρακτηρισμός της ενζυμικής του δραστικότητας από μία ποικιλία ελαιοκάρπων (Olea europaea, ποικιλία Κορωνέικη), η οποία χρησιμοποιείται ευρύτατα στην Ελλάδα για την παραγωγή ελαιολάδου. Επιπλέον επιβεβαιώθηκε και η παρουσία της υπεροξειδάσης σε δείγματα παρθένου ελαιολάδου. Ενεργά εκχυλίσματα υπεροξειδάσης προέκυψαν αρχικά με απλή εκχύλιση τους από ελαιοκάρπους, παρουσία PVP (πολυβινυλοπυρρολιδόνη) σε 50 mM ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, pH 6.0 και στη συνέχεια με επιπλέον καθαρισμό με κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο. Στη συνέχεια η υπεροξειδάση διαχωρίστηκε με χρωματογραφία μοριακού ηθμού σε στήλη Sephacryl S-300 και υπολογίστηκε το μοριακό της βάρος σε 44 ± 1.4 kDa. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, παρουσία SDS, έδειξε μία κύρια πρωτεϊνική ζώνη 43.7 kDa δείχνοντας ότι η POD από ελιές αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η καταλυτική δραστικότητα της υπεροξειδάσης από ελαιοκάρπους εκφράστηκε χρησιμοποιώντας τα συνθετικά υποστρώματα ABTS (2,2-άζινο δις-(3-αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ), DMPD (N,N-διμεθυλο-p-φαινυλοδιαμίνη) και κάποια φαινολικά υποστρώματα που απαντώνται στις ελιές και στο ελαιόλαδο, όπως το πρωτοκατεχοϊκό, γαλλικό και καφεϊκό οξύ, αλλά και τη 4 μέθυλο κατεχόλη που απαντάται στα απόβλητα της ελαιουργίας. Ωστόσο το ένζυμο δεν ήταν ενεργό έναντι της ελευρωπαΐνης, κύριας πολυφαινόλης των ελαιοκάρπων, όπως επίσης και έναντι όλων των μονοφαινολικών ενώσεων που μελετήθηκαν, όπως κουμαρικό, φερουλικό, ασκορβικό και p-ύδροξυ βενζοϊκό οξύ. Το βέλτιστο pH της αντίδρασης που καταλύει η υπεροξειδάση εξαρτάται από το χρησιμοποιούμενο υπόστρωμα και κυμαίνεται μεταξύ των τιμών 4.0 και 6.0. Το ένζυμο διατήρησε την δραστικότητα του όταν αποθηκεύτηκε για 1-2 μήνες στους -18 oC, παρουσία 50 % (v/v) γλυκερόλης. Για το κάθε υπόστρωμα που εξετάστηκε υπολογίστηκαν εκτός από το βέλτιστο pH και οι τιμές των κινητικών χαρακτηριστικών, Km και Vmax. Σύμφωνα με τα παραπάνω, παρατηρήθηκε ότι η αποτελεσματικότητα της υπεροξειδάσης ως καταλύτης εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη χημική δομή του υποστρώματος που καταλύει. Χρησιμοποιώντας το διάγραμμα Arrhenius, υπολογίστηκε η ενέργεια ενεργοποίησης, 37.9 kJ / mol. Μελέτη της κινητικής της σε θερμοκρασίες 30- 60 oC, έδειξε ότι το ένζυμο είναι θερμοανθεκτικό. .......................