Ανίχνευση και χαρακτηρισμός γονιδίων στη χρωμοσωμική περιοχή έλλειψης 13q14 που παρατηρείται στους ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία

Abstract

The minimally deleted area (MDR) of chromosomal loss in 13q14 is contained between the markers D13S319 and D13S25. We characterize an exon obtain through exon trapping performed on the Y933e9 that contains the MDR area of 13q14. The 122bp trapped exon, named 4.10 is expressed in a variety of tissues, recognizing a 1.3kb mRNA, as shown on N/S analysis. A thymus cDNA λgt 10 phage library was hybridized with P³² labelled 4.10 and positive cDNA clones were isolated. DNA sequence of the clones was obtained through cloning and automatic DNA sequencing and compared with ESTs on the db BLAST. The 1.3kb sequence of the 4.10 mRNA was confirmed by a series of RT-PCRs on normal human leukocytes, cloning and sequencing of overlapping PCR products covering the whole 1.3kb 4.10 mRNA sequence. The 4.10 gene contains an ORF of 879bp and predict a protein of 293 aminoacids. The 4.10 protein contains a PHD and a Pfam-B domain, which have a zing finger motif. Proteins with zing finger motif probably can have transcription factor activity. The 4.10 protein is identical with NY-REN-34 protein with renal cell carcinoma. On S/B analysis in CLL patients revealed that the e4.10 is located outside of MDR 13q14.

Η περιοχή της ελάχιστης κοινής έλλειψης σε ασθενείς με ΧΛΛ και έλλειψη 13q14, περιλαμβάνεται μεταξύ των markers D13S319 κεντρομερικά και D13S25. Eπιλέχθηκε το Y933e9 που καλύπτει την περιοχή αυτή, υπεβλήθη σε κλωνοποίηση σε κοσμιδιακό βέκτορα και οι κλώνοι με ανθρώπινο DNA υπεβλήθησαν σε παγίδευση εξονίων. Ένα από το εξόνιο που πήραμε από την παγίδευση εξονίων είναι το e4.10, που με S/B σε ασθενείς με ΧΛΛ αποδείχθηκε ότι είναι εκτός της ελάχιστης περιοχής έλλειψης. Το e4.10 σε N/S αναγνωρίζει mRNA μήκους 1300bp με ευρεία ιστική κατανομή. Χρησιμοποιώντας το e4.10 ως ανιχνευτή μετά από σήμανση με P³², υποβάλλοντας σε υβριδισμό μια λgt10 cDNA βιβλιοθήκη ανθρώπινου θύμου, απομονώθηκε 4.10 θετικός cDNA κλώνος μεγέθους 1.3kb. Έγινε ανάλυση της αλληλουχίας βάσεων του cDNA κλώνου, συγκρίθηκε με άλλο ομόλογο EST μέσω του προγράμματος BLAST. Ακολούθησε επιβεβαίωση της αλληλουχίας του cDNA κλώνου (γονίδιο 4.10) σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς. Πήραμε RNA από περιφερικά λευκά υγιών ατόμων – έγινε ανάστροφη μεταγραφή/(RT PCR) με κατάλληλα ζεύγη εκκινητών. Η αλληλουχία που προέκυψε από την ανάλυση/κλωνοποίηση των PCR προϊόντων ήταν ίδιο με την αλληλουχία του 4.10 cDNA κλώνου. Το γονίδιο 4.10 έχει μήκος 1320 βάσεις, περιέχει ένα ORF 879 βάσεων, κωδικοποιεί πρωτεΐνη 293 αμινοξέων, και η οποία περιλαμβάνει 2 περιοχές με ομολογία με δακτύλους Zn⁺⁺, όρο μπορεί να έχει δραστηριότητα μεταγραφικού παράγοντα και εμφανίζει ομολογία με την πρωτεΪνη NY-REN-34 που παρατηρείται σε ασθενείς με καρκίνο νεφρού.