Μελέτη επιγενετικών μηχανισμών στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία

Abstract

Aberrant DNA methylation is implicated in the pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia (CLL), however its contribution to disease progression has not been conclusively defined. In study I, we investigated the role of DNA methylation changes overtime in a group of CLL patients homogeneously treated with fludarabine, cyclophosphamide and rituximab (FCR). We determined methylation profiles in 34 CLL patients before treatment and at relapse. Overtime analysis highlighted the active role of DNA methylation changes in CLL evolution, particularly in regards to response to chemoimmunotherapy, involving several transcription factors and pathways. The DNA methylation changes showed correlation with the time to first treatment and the time to relapse, hence offering strong evidence regarding the active role of epigenetics in disease evolution, including the response to treatment. Moreover, our findings raise the possibility of using the DNA methylation levels of specific CpGs as prognostic biomarkers. CLL cases show different cytogenetic alterations with clinical value, but it is unclear whether distinct CLL cytogenetic subgroups have different epigenetic landscapes. In study II, we analyzed whether DNA methylation profiles can be linked to the pathophysiology of particular cytogenetic subgroups. We investigated 245 CLL cases carrying del(11q), del(13q) or trisomy 12. The trisomy 12 cases showed distinct DNA methylation patterns, further underscoring their unique biological background. We found low correlation between DNA methylation and gene expression, in line with recent reports. Moreover, integration analysis demonstrated the complexity of the epigenetic markers by linking the DNA methylation data with acetylation and chromatin accessibility data. Finally, del(11q) cases showed a high epigenetic burden (i.e. number of DMCpGs per case compared to memory B cells), which represents a potential predictive biomarker for CLL. Apart from the genetic alterations, CLL cases exhibit distinct immunogetic characteristics such as the antigen receptor stereotypy. The cases belonging to these stereotyped subsets show homogeneous clinicobiologically characteristics, even at epigenetic level. In study III, we analyzed the DNA methylation profiles of patients belonging to stereotyped subset #6 and #8 as well as non-subset U-CLL patients and we found distinct epigenetic signatures. The epigenetic signature showed a low correlation with gene expression in the line of previous reports. The TP63 gene, which is a member of TP53 family, showed the highest differences on DNA methylation levels between the two subsets. Moreover, TP63 was hypomethylated and overexpressed in subset #8, which exhibits the highest risk of Richter syndrome among all CLL subgroups. Altogether, this thesis confirms the significance of DNA methylation in CLL, provides insight into the mechanism of the progression and relapse and further unravels the DNA methylation landscape in cytogenetic subgroups and stereotyped subsets of CLL.

Η μεθυλίωση του DNA διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (ΧΛΛ), ωστόσο ο ρόλος της στην εξέλιξη του νοσήματος δεν έχει μελετηθεί επαρκώς. Στη Μελέτη Ι, διερευνήθηκε ο ρόλος της μεθυλίωσης του DNA στην κλινική απάντηση ασθενών με ΧΛΛ στο ανοσοχημειοθεραπευτικό σχήμα FCR με ιδιαίτερη έμφαση στην ανθεκτικότητα στη θεραπεία. Για το σκοπό αυτό, αναλύθηκαν τα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA σε 34 περιπτώσεις ασθενών πριν τη χορήγηση θεραπείας και μετά την υποτροπή. H ανάλυση των διαχρονικών δειγμάτων προσέφερε σημαντικές ενδείξεις για την ενεργό συμμετοχή των αλλαγών της μεθυλίωσης του DNA στην εξέλιξη της ΧΛΛ, ειδικότερα στην υποτροπή μετά από την χορήγηση FCR, εμπλέκοντας στη διαδικασία συγκεκριμένους μεταγραφικούς παράγοντες και βιολογικά μονοπάτια. Οι αλλαγές στα πρότυπα της μεθυλίωσης του DNA βρέθηκαν να συσχετίζονται τόσο με το χρόνο έως την πρώτη θεραπεία όσο και με τον χρόνο έως την υποτροπή, εύρημα που αποτελεί σημαντική ένδειξη για τον ρόλο των επιγενετικών τροποποιήσεων στην απάντηση στη θεραπεία και, γενικότερα, στην εξέλιξη της νόσου. Τέλος, αναδείχθηκε η δυνατότητα χρήσης των επιπέδων μεθυλίωσης συγκεκριμένων θέσεων CpG ως πιθανών βιοδεικτών με προβλεπτική αξία. Οι ασθενείς με ΧΛΛ συχνά φέρουν χρωμοσωμικές αλλοιώσεις οι οποίες εμπλέκονται στην παθογένεση της νόσου και έχουν ισχυρό αντίκτυπο στην κλινική πορεία και την έκβαση των ασθενών. Παραμένει άγνωστο εάν οι συγκεκριμένες γενετικές αλλαγές σχετίζονται με ιδιαίτερα επιγενετικά πρότυπα. Για το σκοπό αυτό, στη Μελέτη ΙΙ αναλύθηκαν 245 περιπτώσεις που φέρουν συχνές κυτταρογενετικές βλάβες στη ΧΛΛ: (i) έλλειψη στο χρωμόσωμα 11q [del(11q)], (ii) έλλειψη στο χρωμόσωμα 13q [del(13q)], (iii) τρισωμία 12 [tris12]. Οι περιπτώσεις που έφεραν τρισωμία 12 εμφάνισαν διακριτά πρότυπα μεθυλίωσης DNA, υπογραμμίζοντας περαιτέρω το ιδιαίτερο βιολογικό υπόβαθρο αυτής της υποομάδας. Η χαμηλή συσχέτιση των μεταβολών στα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA με τις μεταβολές στην γονιδιακή έκφραση επιβεβαιώθηκε στη συγκεκριμένη μελέτη, σε συμφωνία με παλαιότερες αναφορές. Παράλληλα, αναδείχθηκε η πολυπλοκότητα της αλληλεπίδρασης των επιγενετικών προτύπων συνδέοντας δεδομένα μεθυλίωσης του DNA με δεδομένα ακετυλίωσης και ανοιχτής χρωματίνης. Τέλος, η συσχέτιση του δυσμενούς προγνωστικού del(11q) με το αυξημένο επιγενετικό φορτίο, δηλαδή τον αριθμό των διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις CpG (ΔΜCpG) μεταξύ του δείγματος προ-θεραπείας κάθε ασθενούς και Β κυττάρων μνήμης, υποδηλώνει τη δυνατότητα χρήσης του επιγενετικού φορτίου ως δείκτη δυσμενούς πρόγνωσης. Οι ασθενείς με ΧΛΛ εκτός από τις γενετικές βλάβες που φέρουν, εμφανίζουν ιδιαίτερα ανοσογενετικά χαρακτηριστικά όπως η στερεοτυπία του Β κυτταρικού υποδοχέα. Οι ασθενείς που ανήκουν στα διακριτά αυτά υποσύνολα δημιουργούν κλινικοβιολογικά ομοιογενείς ομάδες, ακόμα και σε επίπεδο επιγενετικής. Στη Μελέτη ΙΙΙ., διερευνήσαμε τα πρότυπα μεθυλίωσης του DNA σε ασθενείς των στερεότυπων υποσυνόλων #6 και #8 όπως επίσης και σε άλλους ασθενείς με αμετάλλακτα γονίδια IGHV (Α-ΧΛΛ) και διαπιστώσαμε διακριτές επιγενετικές υπογραφές. Η επιγενετική υπογραφή έδειξε χαμηλή συσχέτιση με την γονιδιακή έκφραση, σε συμφωνία με την υπάρχουσα βιβλιογραφία. Μεταξύ των γονιδίων με διαφορική μεθυλίωση, τις μεγαλύτερες διαφορές εμφάνιζε το TP63, μέλος της οικογένειας γονιδίων TP53. Πιο λεπτομερώς, το TP63 ήταν υπομεθυλιωμένο και επίσης βρέθηκε να υπερεκφράζεται στο υποσύνολο #8, το οποίο εμφανίζει τον υψηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης συνδρόμου Richter μεταξύ όλων των υποομάδων ΧΛΛ. Συνολικά, η παρούσα διατριβή επιβεβαιώνει τη σημασία της μεθυλίωσης του DNA στην ΧΛΛ, παρέχοντας σημαντικές ενδείξεις για τη συμμετοχή της στο μηχανισμό της εξέλιξης και της υποτροπής και αποκαλύπτοντας το τοπίο μεθυλίωσης του DNA σε διακριτές κυτταρογενετικές και στερεοτυπικές υποομάδες της ΧΛΛ.