Χαρακτηρισμός υπεράριθμων χρωμοσωμάτων - δεικτών στον προγεννητικό έλεγχο

Abstract

Small supernumerary marker chromosomes (sSMCs) are defined as structural chromosomal abnormalities of equal or smaller size than chromosome 20 that can not be characterised and identified by classical cytogenetic techniques. A sSMC can appear in a karyotype with (1) 46 normal chromosomes, (2) numerical aneuploides (e.g. Turner syndrome or Down syndrome) or (3) in balanced translocations. The sSMCs appear with an incidence of 0.075% in random cases of prenatal screening while merely 0.044% in postnatal cases. The incidence of sSMCs in cases of prenatal screening with having ultrasound abnormalities is at least five times greater than in neonates and at least three times greater whom compared to random prenatal screening cases. Furthermore 0.288% of patients with neuro/developmental retardation have a sSMC. Approximately 70% of de novo sSMCs in prenatal screening cases have no phenotypical manifestations. The risk for phenotypic abnormalities in cases of prenatal screening detection amounts to approximately 13%. That is depends on the origin of the marker chromosome as well as on whether this is appearing for the first time in that embryo (de novo) or familial. The risk can vary from 7% when the de novo sSMC comes from chromosomes 13, 14, 15, 21 and 22 and is up to 28% for non-acrocentric chromosomes. In addition more than 98% of hereditary sSMCs are without phenotypic consequence. In prenatal screening, however, 16% of sSMCs have clinical consequences. In particular the risk for phenotypic abnormalities for sSMCs that originate from acrocentric chromosomes amounts to 10.9% and up to 14% for non-acrocentric sSMCs. We do not know a great deal about on to the exact mechanism of sSMC formation and in particular it is unclear where, when and why, an sSMC is created during gametogenesis or embryogenesis. However there are various models of how the various types of sSMCs are created. These theories are based on findings from UPD (uni parental disomy) studies and on the observation that sSMCs can be created from incomplete correction of a trisomy. In general a sSMC is created by the additive effect of two or more incidents during gametogenesis or embryogenesis.Usually the presence of an sSMC in a patient is confirmed using chromosomal banding from peripheral blood sample, amniotic fluid or chorionic villus samples. If cytogenetic analysis reveals an sSMC, then this has to be further characterised using molecular cytogenetic techniques. Today with the development of molecular cytogenetics and the use of array-CGH almost all chromosomal imbalances can be characterised. The aim of this study was to fully investigate sSMCs that are found in prenatal samples so that the right prognosis as well as genetic counselling can be given. The ultimate goal of the study was to correlate the genotype with the phenotype and in particular with the ultrasound findings as well as the clinical picture of the neonates in cases of continued pregnancies. The research work focused on characterising and identifying marker chromosomes in samples of prenatal screening and concurrently studying the presence or absence of euchromatic regions utilising classical cytogenetic and molecular cytogenetic techniques (fluorescent in situ hybridization (FISH) and array- CGH). At the same time the presence or absence of uniparental disomy (UPD) was studied, focusing on marker chromosomes whose origin came from chromosomes involved in monogenic disomy. For this reason a molecular analysis for the presence or absence of UPD was performed in sSMC cases with a high risk for UPD. A total 42 sSMCs where successfully characterised, drawn from approximately 50,000 prenatal samples of amniotic fluid and chorionic villi. The results of the current study confirmed the contribution of molecular cytogenetic techniques (FISH and Array-CGH) towards the precise characterisation of sSMCs identified during prenatal screening. By utilising FISH and array-CGH we were able to successfully characterise all 42 sSMCs that where detected using classical cytogenetic techniques. On top of the chromosomal origin of the sSMC we identified the presence or absence, size of euchromatin as well as its constituent genes. In total 19/42 (45%) of cases this study are connected with important clinical findings, resulting in accurate genetic counselling for the couples.In the current study if we had utilised only array-CGH technique we would have missed 16 cases of sSMCs that were comprised exclusively from heterochromatic material. In 12/16 cases the sSMC originated from chromosomes for which UPD analysis was necessary. Conversely non utilisation of array-CGH would not reveal the complexity of some sSMCs. In addition it are us the possibility for a detailed characterisation of these sSMCs as a result of which a clearer view of the prognosis and genetic counselling was obtained. The extended practice of array-CGH will reveal more surprises and an possibly differentiate the opinion for the exact composition of supernumerary chromosomal markers.In conclusion molecular cytogenetics (FISH, array-CGH) in combination with other molecular techniques (UPD) can provide valuable information regarding the chromosomal origin and composition of marker chromosomes in prenatal diagnosis. With the advent of new technologies, like array-CGH, it will be possible to fully characterise the genetic components of every sSMC and in special cases to describe and predict the possible clinical phenotype.

Τα μικρά υπεράριθμα χρωμοσώματα-δείκτες (sSMCs) ορίζονται ως δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες, μεγέθους ίσου ή μικρότερου από το χρωμόσωμα 20 που δεν μπορούν να χαρακτηρισθούν και να ταυτοποιηθούν με τις κλασικές κυτταρογενετικές τεχνικές. Ένα sSMC μπορεί να εμφανίζεται σε καρυότυπο με (1) 46 φυσιολογικά χρωμοσώματα, (2) αριθμητικές ανωμαλίες (π.χ. Turner syndrome ή Down syndrome), ή (3) δομικές ισοζυγισμένες ανωμαλίες. Τα sSMCs εμφανίζονται με συχνότητα 0.075% σε μη επιλεγμένα περιστατικά προγεννητικού ελέγχου ενώ μόνο 0.044% σε μεταγεννητικά περιστατικά. Η συχνότητα των sSMC στα περιστατικά προγεννητικού ελέγχου με υπερηχογραφικές ανωμαλίες είναι τουλάχιστον πέντε φορές μεγαλύτερη από ότι στα νεογνά και τουλάχιστον τρεις φορές υψηλότερη από ότι στα μη επιλεγμένα προγεννητικά περιστατικά. Επίσης 0.288% των ασθενών με αναπτυξιακή/νοητική υστέρηση έχουν ένα sSMC. Περίπου το 70% των de novo sSMC δεν έχει φαινοτυπικές επιπτώσεις. Ο κίνδυνος για φαινοτυπικές ανωμαλίες σε περιπτώσεις προγεννητικής εντόπισης ανέρχεται περίπου στο 13%. Αυτό εξαρτάται τόσο από την προέλευση του χρωμοσώματος-δείκτη, όσο και από το εάν εμφανίζεται για πρώτη φορά στο έμβρυο (de novo), ή είναι οικογενής (familial). Ο κίνδυνος μπορεί να κυμαίνεται από 7% όταν το de novo sSMCs προέρχεται από τα χρωμοσώματα 13, 14, 15, 21 και 22, έως το 28% για τα μη ακροκεντρικά χρωμοσώματα. Επίσης, περισσότερα από 98% των κληρονομούμενων sSMC είναι χωρίς φαινοτυπικές επιπτώσεις. Στον προγεννητικό έλεγχο το 16% των sSMC έχει κλινικές επιπτώσεις. Πιο συγκεκριμένα ο κίνδυνος για φαινοτυπικές ανωμαλίες ανέρχεται στο 10.9% για τα sSMC που προέρχονται από ακροκεντικά χρωμοσώματα και φθάνει στο 14% για τα μη ακροκεντρικά sSMC.Δεν γνωρίζουμε πάρα πολλά σχετικά με τον ακριβή τρόπο σχηματισμού των sSMC και είναι ιδιαίτερα ασαφές, πού, γιατί και πότε δημιουργείται ένα sSMC, κατά την διάρκεια της γαμετογένεσης ή της εμβρυογένεσης. Πάντως, υπάρχουν διάφορα μοντέλα του πώς δημιουργούνται οι διάφορες μορφές sSMC. Αυτές οι θεωρίες βασίζονται στα ευρήματα από το UPD και στην παρατήρηση ότι τα sSMCs μπορεί να δημιουργούνται από ατελή διόρθωση της τρισωμίας. Συνολικά, ένα sSMC σχηματίζεται από τον συνδυασμό δύο ή περισσοτέρων συμβάντων κατά της διάρκεια της γαμετογένεσης ή της εμβρυογένεσης.Κλασικά, η παρουσία ενός sSMC σε ένα ασθενή τεκμηριώνεται με την ζώνωση και ανάλυσή των χρωμοσωμάτων, είτε στο περιφερικό αίμα, είτε στο αμνιακό υγρό ή στις χοριακές λάχνες. Εάν με την κυτταρογενετική ανάλυση παρατηρηθεί ένα sSMC, τότε αυτό πρέπει να χαρακτηρισθεί περαιτέρω με μοριακές κυτταρογενετικές τεχνικές. Σήμερα με την ανάπτυξη της μοριακής κυτταρογενετικής και την χρήση των array-CGH μπορούν να χαρακτηριστούν σχεδόν όλες οι χρωμοσωμικές ανισοζυγίες.Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθούν πλήρως τα sSMCs που εντοπίζονται σε δείγματα προγεννητικού ελέγχου, προκειμένου να δοθεί σωστή πρόγνωση και γενετική συμβουλευτική. Απώτερος στόχος της μελέτης ήταν να γίνει συσχέτιση του γονότυπου με το φαινότυπο, και ειδικότερα με τα υπερηχογραφικά ευρήματα αλλά και την κλινική εικόνα του νεογνού σε περιπτώσεις συνέχισης της κύησης. Συγκεκριμένα, η μελέτη εστιάστηκε στο χαρακτηρισμό και ταυτοποίηση των χρωμοσωμάτων δεικτών σε δείγματα προγεννητικού ελέγχου και συγχρόνως στη μελέτη της παρουσίας ή όχι ευχρωματικής περιοχής, εφαρμόζοντας τεχνικές κλασικής κυτταρογενετικής και τεχνικές μοριακής κυτταρογενετικής (φθορίζων in situ υβριδισμός, FISH και array-CGH).Παράλληλα μελετήθηκε η παρουσία ή όχι μονογονεϊκής δισωμίας (UPD), εστιάζοντας στα χρωμοσώματα δείκτες των οποίων η προέλευσή ήταν από χρωμοσώματα που εμπλέκονται σε μονογονεϊκή δισωμία. Για το σκοπό αυτό έγινε μοριακή ανάλυση για την ύπαρξη ή όχι μονογονεϊκής δισωμίας στα περιστατικά με υπεράριθμο μικρό χρωμόσωμα-δείκτη που έχουν αυξημένο κίνδυνο για UPD. Χαρακτηρίσθηκαν επιτυχώς 42 χρωμοσώματα δείκτες που εντοπίσθηκαν σε περίπου 50.000 προγεννητικά δείγματα αμνιακού υγρού και χοριακών λαχνών. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, ανέδειξαν τη συμβολή των μοριακών κυτταρογενετικών τεχνικών (FISH και array-CGH) στον ακριβή χαρακτηρισμό των μικρών χρωμοσωμάτων – δεικτών μετά τον εντοπισμό τους στον προγεννητικό έλεγχο. Χρησιμοποιώντας τεχνικές FISH και array-CGH στην παρούσα μελέτη κατορθώσαμε να χαρακτηρίσουμε επιτυχώς και τα 42 sSMCs που ανιχνεύθηκαν με την κλασσική κυτταρογενετική. Εκτός από την χρωμοσωμική προέλευση του sSMC προσδιορίσθηκε η παρουσία ή όχι ευχρωματίνης, το μέγεθος αυτής και ο αριθμός των γονιδίων που περιέχει. Συνολικά 19/42 (45%) περιπτώσεις από την συγκεκριμένη μελέτη συνδέονται με σημαντικά κλινικά ευρήματα. Αποτέλεσμα αυτών είναι να δοθούν σωστές γενετικές συμβουλές στα ζευγάρια.Στη παρούσα μελέτη εάν χρησιμοποιείτο μόνο η τεχνική array-CGH δεν θα είχαν ανιχνευθεί 16 περιπτώσεις sSMCs που αποτελούντο αποκλειστικά από ετεροχρωματικό υλικό. Στις 12/16 περιπτώσεις τo sSMC προέρχονταν από χρωμοσώματα όπως το 14 ή το 15 που ήταν απαραίτητη η ανάλυση UPD. Αντίθετα η μη χρησιμοποίηση των array-CGH δεν θα αποκάλυπτε την πολυπλοκότητα κάποιων sSMCs ούτε τον λεπτομερή χαρακτηρισμό αυτών των sSMCs, με αποτέλεσμα να μην υπάρχει σαφής εικόνα για την πρόγνωση και την γενετική συμβουλευτική. Η εκτεταμένη εφαρμογή του array-CGH αποκαλύπτει περισσότερες εκπλήξεις και πιθανόν να διαφοροποιηθεί η άποψη σχετικά με τη σύνθεση των υπεράριθμων χρωμοσωμάτων δείκτων. Συμπερασματικά η μοριακή κυτταρογενετική (FISH, array-CGH) σε συνδυασμό με άλλες μοριακές τεχνικές (UPD) μπορεί να παράσχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την χρωμοσωμική προέλευση και τη σύνθεση των χρωμοσωμάτων δεικτών στην προγεννητική διάγνωση. Με τη νέα τεχνολογία array-CGH είναι δυνατό να χαρακτηριστεί πλήρως το γενετικό περιεχόμενο του κάθε δείκτη και, σε ειδικές περιπτώσεις, να περιγραφεί και να προβλεφθεί ο πιθανός κλινικός φαινότυπος.