Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα p63 στη Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία

Abstract

Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL), the most frequent leukemia in Western world, is characterized by a remarkably variable clinical course, likely as a reflection of the underlying biological heterogeneity. The latter is shaped by different cellular mechanisms and factors contributing to disease pathogenesis. Recent evidence has highlighted that the TA-isoform of the p63 transcription factor (TAp63) affects CLL cells viability and likely contributes to clinical aggressiveness, albeit in a hitherto elusive way. In CLL, TAp63 expression, is modulated by both immune signaling and epigenetic modifications. In activated normal B cells, the TAp63 transcription factor activates the BCL2 gene, participating in the NF-κB/TAp63/BCL2 anti-apoptotic pathway. On these grounds, here, we sought to further understand and define the role of TAp63 in the pathophysiology of CLL and also to explore molecular links between TAp63 and BCL2 in CLL cells.First, we performed TAp63 mRNA expression analysis in distinct subgoups of patients and found that elevated TAp63 expression levels are linked with adverse prognostic features and clinical outcomes, including shorter time-to-first treatment and overall survival. Moreover, we analyzed TAp63 mRNA expression in longitudinal samples of CLL cases treated with either chemoimmunotherapy or signaling inhibitors to report that TAp63 is overexpressed in relapse/refractory disease. Next, we explored molecular links between TAp63 and BCL2 in CLL cells and documented a strong correlation at both the protein and the mRNA levels, alluding to the potential prosurvival role of TAp63 in the following settings: a) both stimulated and unstimulated primary CLL cells; and, b) primary CLL cells after TAp63 downregulation by RNA interference. This finding was further supported by inducible downregulation of TAp63 expression in the MEC1 CLL cell line using CRISPR, which resulted in downregulation of BCL2 expression. In order to elucidate the transcriptional network of TΑp63, we performed ChIP-sequencing and identified high-confidence TAp63 binding regions in genes implicated in disease pathogenesis that regulate cellular processes necessary for cell survival. Furthermore, we examined whether BCL2 might constitute a transcriptional target of TAp63 and reported a significant binding profile of TAp63 in the BCL2 gene locus, across a genomic region previously characterized as a super-enhancer in CLL. Finally, we found that up-regulated TAp63 expression levels render CLL cells less responsive to apoptosis induction with the BCL2 inhibitor, venetoclax. Collectively, TAp63 emerges as a positive modulator of BCL2, hence contributing to the anti-apoptotic phenotype that underlies clinical aggressiveness and treatment resistance in CLL.

Η Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) είναι η πιο συχνή αιματολογική κακοήθεια στη Δύση. Χαρακτηρίζεται από αξιοσημείωτη κλινική ετερογένεια η οποία είναι συνυφασμένη με την ετερογένεια που παρατηρείται σε βιολογικό επίπεδο, με πολλούς διαφορετικούς κυτταρικούς μηχανισμούς να συνεισφέρουν στην ανάπτυξη και την εξέλιξη της νόσου. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει ότι ο μεταγραφικός παράγοντας p63, και συγκεκριμένα η ισομορφή του ΤΑp63, επηρεάζει την επιβίωση των ΧΛΛ κυττάρων και κατ΄επέκταση την κλινική επιθετικότητα των ασθενών μέσω άγνωστων μηχανισμών. Η έκφραση της TAp63 στη ΧΛΛ ρυθμίζεται τόσο μέσω επιγενετικών τροποποιήσεων όσο και από ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος του λευχαιμικού κλώνου. Στα φυσιολογικά ώριμα Β κύτταρα η TAp63 επάγει την πρωτεΐνη BCL2 και προάγει την επιβίωση τους συμμετέχοντας στο αντιαποπτωτικό μονοπάτι NFκB/TAp63/BCL2. Σε αυτό το πλαίσιο, στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε σε μοριακό επίπεδο ο ρόλος της ΤΑp63 και η συσχέτιση της με την BCL2 έτσι ώστε να αναδειχθούν τα ρυθμιστικά κυκλώματα μέσω των οποίων η TAp63 επηρεάζει την επιβίωση των λευχαιμικών κυττάρων.Αρχικά πραγματοποιήθηκε μελέτη της έκφρασης του ΤΑp63 σε επίπεδο mRNA σε διαφορετικές υποομάδες ασθενών με ΧΛΛ και διαπιστώθηκε πως εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα σε ασθενείς με δυσμενή προγνωστικά χαρακτηριστικά ενώ τα υψηλά επίπεδα έκφρασής της συσχετίζονται με μικρότερο χρόνο έως την πρώτη θεραπεία αλλά και μικρότερη ολική επιβίωση. Επιπλέον, ύστερα από μέτρηση της έκφρασης του TAp63 σε διαχρονικά δείγματα ασθενών με ΧΛΛ που είχαν λάβει θεραπεία, βρέθηκε πως υπερεκφράζεται σε περιπτώσεις ανθεκτικής/υποτροπιάζουσας ΧΛΛ τόσο ύστερα από ανοσοχημειοθεραπεία όσο και ύστερα από θεραπεία με αναστολείς σηματοδότησης. Αναφορικά με τη μοριακή διασύνδεση μεταξύ TAp63 και BCL2, παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των δύο σε επίπεδο mRNA και σε πρωτεϊνικό επίπεδο στις ακόλουθες συνθήκες: α) πρωτογενή κύτταρα ασθενών με ΧΛΛ που βρίσκονταν τόσο σε αδιέγερτη όσο και σε διεγερμένη κατάσταση και β) πρωτογενή κύτταρα ασθενών με ΧΛΛ μετά από καταστολή της έκφρασης του γονιδίου TAp63 με RNA παρεμβολή. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν επιπλέον και στην κυτταρική σειρά MEC1 η οποία είχε τροποποιηθεί γενετικά έτσι ώστε να υποεκφράζει τo TAp63 κατά επαγόμενο τρόπο, όπου η καταστολή του γονιδίου είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της έκφρασης του γονιδίου BCL2. Στη συνέχεια, με σκοπό να αποσαφηνιστεί το σύνολο των μεταγραφικών στόχων του μεταγραφικού παράγοντα TAp63 πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης ακολουθούμενη από αλληλούχηση νέας γενιάς τόσο σε πρωτογενή κύτταρα ασθενών με ΧΛΛ όσο και στην κυτταρική σειρά MEC1. Και στις δύο περιπτώσεις, μεταξύ των γονιδίων – στόχων αναγνωρίστηκαν γονίδια που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία της ΧΛΛ και ρυθμίζουν καίριες κυτταρικές διεργασίες. Σχετικά με το BCL2, ανιχνεύθηκε ισχυρή πρόσδεση της TAp63 σε περιοχή του γονιδίου που είναι χαρακτηρισμένη ως υπερ-ενισχυτής της μεταγραφής, ενισχύοντας την υπόθεση πως η ΤΑp63 λειτουργεί ως θετικός ρυθμιστής του BCL2 στα κύτταρα της ΧΛΛ. Τέλος, διερευνήθηκε η πιθανή κλινική σημασία των παραπάνω ευρημάτων μέσω ex vivo αξιολόγησης του φαρμακολογικού αναστολέα της BCL2 Venetoclax σε πρωτογενή κύτταρα ασθενών με ΧΛΛ που εξέφραζαν διαφορικά επίπεδα TAp63. Οι περιπτώσεις που εξέφραζαν υψηλά επίπεδα ΤΑp63 βρέθηκαν να εμφανίζουν μεγαλύτερη αντοχή στον αναστολέα.Συνολικά, στην παρούσα εργασία προσφέρονται ισχυρές ενδείξεις ότι ο μεταγραφικός παράγοντας ΤAp63 συμμετέχει στους μηχανισμούς που προσδίδουν κλινική επιθετικότητα και χημειοανθεκτικότητα στη ΧΛΛ, μέσω κυτταρικών μηχανισμών που εμπλέκουν τον αντι-αποπτωτικό παράγοντα ΒCL2.