Ενζυμικός αποπολυμερισμός αμυλούχων υλικών προς αξιοποιήσιμα ολιγομερή και μονομερή σε διάφορα υδατικά συστήματα

Abstract

In this thesis the enzymic depolymerization of starches to yield valuable oligomers and monomers in various aqueous systems was studied. A variety of substrates and amylolytic enzymes were used and the reaction products as well as their yields were determined. The reactions were carried out in both aqueous and in two-phase systems. Crude substrates were examined and the research was directed to the construction of alternative starch hydrolysis procedures in pilot scale. In the first series of experiments the parameters that affect the hydrolysis reaction were examined such as the use of crude starches, the use of various enzymes and the reaction conditions. The reactions were carried out in aqueous and in two-phase systems. The yields of each combination as well as the reaction products were determined by chromatometric methods and by HPLC. In the second series of experiments alternative procedures for enzymic hydrolysis of starch were constructed in one or two phase systems aiming in the replacement of dextran and the better utilization of enzymes. The systems of polyethylene glycol/gelatinized starch and polyethylene glycol/ starch were studied and compared to the polyethylene glycol/dextran two-phase system as well as to the aqueous starch slurry. The results showed that for glucose production from starch hydrolysis, wet milling cornstarch gives the best results. 10% (w/v) Starch concentration gives sufficient phase separation and sugars production. In the case where gelatinized starch is used the substrate concentration is confined to 5% (w/v). Concerning enzymes, a-amylase from B. licheniformis (concentration 5.6 U/ml) and glucoamylase from A. niger (concentration 2.8 U/ml) where used. Their combination proved to be the best in terms of stability and reaction yield, while the simultaneous application of both enzymes increases significantly the reaction yield. In the second part of the thesis, dealing with alternative hydrolysis procedures, from the systems studied, the systems of polyethylene glycol/gelatinized starch comprised of 7.5% (w/v) polyethylene glycol of molecular weight 10,000 and 5% (w/v) gelatinized starch and polyethylene glycol/starch system comprised of 5% (w/v) polyethylene glycol of molecular weight 10,000 and 10% (w/v) starch were used. Both systems were stable during the semi-continuous hydrolysis of starch. The polyethylene glycol/starch system is preferable as it presents more and stable polyethylene glycol phase whereas the polyethylene glycol/gelatinized starch gives less polyethylene glycol phase in each cycle. In addition, glucose production is higher in the polyethylene glycol/starch system. Taking into account that for starch gelatinization energy is consumed, the polyethylene glycol/starch system becomes more attractive. Those systems are capable of conducting semi-continuous starch hydrolysis and in combination with an ultrafiltration membrane they present the potential of enzyme and polymers recycling compared to the conventional method used so far.

Η παρούσα διατριβή έχει ως αντικείμενο τον Ενζυμικό αποπολυμερισμό αμυλούχων υλικών προς αξιοποιήσιμα ολιγομερή και μονομερή σε διάφορα υδατικά συστήματα. Χρησιμοποιήθηκαν διάφορα αμυλολυτικά ένζυμα, μελετήθηκε η αντίδραση υδρόλυσης διαφόρων αμυλούχων υποστρωμάτων, ταυτοποιήθηκαν τα προϊόντα της υδρόλυσης και προσδιορίστηκαν οι αποδόσεις στα διάφορα προϊόντα. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν τόσο σε υδατικό όσο και σε σύστημα δύο φάσεων. Έγινε έλεγχος ακατέργαστων αμυλούχων υλικών και έρευνα προς την κατάστρωση οικονομικότερων διεργασιών υδρόλυσης αμύλου σε πιλοτική κλίμακα. Στην πρώτη σειρά πειραμάτων μελετήθηκαν οι παράμετροι που επηρεάζουν την αντίδραση υδρόλυσης του αμύλου όπως η χρήση ακατέργαστων αμυλούχων υλικών, η χρήση διαφόρων ενζύμων και οι συνθήκες της αντίδρασης. Οι αντιδράσεις μελετήθηκαν τόσο σε υδατικά συστήματα όσο και σε συστήματα δύο φάσεων. Προσδιορίστηκαν οι αποδόσεις κάθε συνδυασμού καθώς και τα προϊόντα της εκάστοτε αντίδρασης. Στη δεύτερη σειρά πειραμάτων καταστρώθηκαν εναλλακτικές μέθοδοι ενζυμικής υδρόλυσης αμύλου σε διφασικά και μονοφασικά υδατικά συστήματα με σκοπό την αντικατάσταση της δεξτράνης και την καλύτερη αξιοποίηση των αμυλολυτικών ενζύμων. Εξετάστηκαν συστήματα πολυαιθυλενογλυκόλης/ζελατινοποιημένου αμύλου, πολυαιθυλενογλυκόλης/αμύλου και συγκρίθηκαν με αντίστοιχα συστήματα πολυαιθυλενογλυκόλης/δεξτράνης καθώς και με υδατικό διάλυμα αμύλου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι για την παραγωγή γλυκόζης από την υδρόλυση του αμύλου, η χρήση καλαμποκιού υγρής άλεσης δίνει τα καλύτερα αποτελέσματα. 10% (w/v) συγκέντρωση αμύλου παρέχει ικανοποιητικό διαχωρισμό φάσεων και παραγωγή σακχάρων. Στην περίπτωση της χρήσης ζελατινοποιημένου αμύλου η συγκέντρωση του υποστρώματος περιορίζεται σε 5% (w/v). Τα ένζυμα που επιλέχθηκαν είναι α-αμυλάση από B. licheniformis (συγκέντρωση 5.6 U/ml) και γλυκοαμυλάση από A. niger (συγκέντρωση 2.8 U/ml). Ο συνδυασμός τους αποδείχθηκε ο καλύτερος από πλευράς σταθερότητας και αποδόσεως ενώ η ταυτόχρονη χρήση των ενζύμων αυξάνει σημαντικά την απόδοση της αντίδρασης υδρόλυσης, σε σχέση με αυτή για μεμονωμένα ένζυμα, λόγω της συνεργιστικής τους δράσης. Όσον αφορά τη χρήση των παραπάνω δεδομένων σε εναλλακτικές μεθόδους ενζυμικής υδρόλυσης αμύλου, από τα συστήματα που μελετήσαμε καταλήξαμε σε δύο συστήματα. Α) Σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης/ζελατινοποιημένου αμύλου με 7.5% (w/v) πολυαιθυλενογλυκόλη μοριακού βάρους 10,000 και 5% (w/v) ζελατινοποιημένο άμυλο και Β) σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης/αμύλου με 5% (w/v) πολυαιθυλενογλυκόλη μοριακού βάρους 10,000 και 10% (w/v) άμυλο. Και τα δύο συστήματα ήταν σταθερά στην ημισυνεχή υδρόλυση αμύλου. Το σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης/αμύλου όμως παρουσιάζει καλύτερα χαρακτηριστικά καθώς εμφανίζει περισσότερη και πιο σταθερή φάση πολυαιθυλενογλυκόλης, ενώ στο σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης/ζελατινοποιημένου αμύλου η φάση πολυαιθυλενογλυκόλης σταδιακά μειώνεται. Επίσης, η παραγωγή γλυκόζης στο σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης/αμύλου είναι μεγαλύτερη και η απόδοση του συστήματος πιο σταθερή. Δεδομένου ότι το σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης/ζελατινοποιημένου αμύλου απαιτεί ζελατινοποίηση του αμύλου, που συνεπάγεται κατανάλωση ενέργειας, το σύστημα πολυαιθυλενογλυκόλης/αμύλου γίνεται ακόμη πιο ελκυστικό. Τα συστήματα αυτά επιτρέπουν την ημισυνεχή υδρόλυση αμύλου και σε συνδυασμό με μεμβράνη υπερδιήθησης παρέχουν τη δυνατότητα ανακύκλωσης ενζύμων και πολυμερών ξεπερνώντας τα μειονεκτήματα της συμβατικής μεθόδου.