Παρασκευή σύνθετων νανογαλακτωμάτων τροφίμων και διατήρησή τους σε ψύξη

Abstract

The new trend in food industry has been focused on fortification of foods with health-promoting ingredients (nutrients and nutraceuticals) specifically designed to improve human health and well-being. Many of these bioactive components categorized either as hydrophilic (vitamins, minerals, polyphenols) or lipophilic components (polyunsaturated lipids, oil-soluble vitamins, phytosterols, curcuminoids, carotenoids, and flavonoids). Thus, many food-grade delivery systems have been developed (nanoemulsions, liposomes, nanoparticles) to incorporate active ingredient. Nanosized structures such as nanoemulsions are regarded as useful tools with great potential in the food sector for the delivery of food ingredients. Moreover, in the last decade, the introduction of more efficient emulsification technologies and highly surface-active emulsifiers facilitated the large-scale production of nanoemulsions. Nanoemulsions are metastable colloidal dispersions, consisting of one liquid being dispersed in the form of small spherical droplets to another immiscible liquid. They are thermodynamically unstable systems but kinetically stable presenting high resistance to structural changes through time such as coalescence, flocculation, and gravitational separation. Nowadays, nanoemulsions are gaining increased interest as delivery and encapsulation systems for various bioactive ingredients, due to their unique functional characteristics and physicochemical properties, such as high physical stability and optical clarity/transparent appearance as well as enhanced bioavailability. Due to the abovementioned properties, they are considered as excellent delivery systems controlling the quality, the flavor, and the antimicrobial properties of products and also the bioavailability of the incorporated compound. Double nanoemulsions are complex polydispersed multiphase systems consisting of a nanoemulsion dispersed in a continuous phase. Most studies focus on water-in-oil-in-water multiple nanoemulsions rather than oil-in-water-in-oil (o1/w/o2) type. Multiple o1/w/o2nanoemulsions presents various advantages as delivery systems due to their compartmentalized structure, as they can simultaneously deliver both oil-soluble and water-soluble compounds, while protecting them against chemical degradation. Despite their potential in product development, the production of o1/w/o2multiple nanoemulsions is practically limited due to their increased instability. Double emulsions are often produced by a two-step emulsification method using various high-shear devices, high pressure- homogenizers, microfluidizers and membrane systems. The formation of the final double nanoemulsion using ultrasound-assisted two-step homogenization process gain more a more as the ultrasonic device is more effective producing small droplets at less process time. The stability of multiple emulsions is influenced by their composition and emulsification conditions. The first step is to prepare an inner phase with very small droplets preventing, while in the second step the first emulsion should be dispersed in a second continuous phase with a high yield of inner droplets and with smaller external droplets. Nowadays, there has been a growing demand to fortify foods with health-promoting ingredients such as conjugated linoleic acid (CLA) or coenzyme Q10 (CoQ10) using food-delivery systems. CLA is gaining recognition as a food supplement due to its significant physiological activities. CoQ10 which is an endogenous essential molecule for the human body is also known as an excellent antioxidant compound. However, these lipophilic bioactive compounds, due to their physical or chemical instability or water insolubility, cannot simply be incorporated into these products. The nanoemulsions, in order to be effective delivery systems, should maintain their droplet size, be resistant to creaming while they should protect the incorporated bioactive ingredients during shelf-life (retention percent). Given the above, designing nanoemulsions and multiple nanoemulsions with long-term shelf-life under refrigerated and environmental storage is an essential goal for industries. The aim of this study was to investigate and understand the effect of the destabilization phenomena during manufacture, storage, and the affecting factors of these systems such as the ratio of dispersed and continuous phase, the composition of the oil phase, the type of emulsifiers, the droplet size and distribution of dispersed phase and the potential presence of compounds with emulsifying and surface-active characteristics. The nature of the lipid phase plays crucial role determining the droplet size, the viscosity, the stability and the interfacial tension of the emulsions. Various lipid types have already been examined in multiple emulsions production, however, there are limited studies on extra virgin olive (EVOO) and olive pomace oil (OPO) as lipid phase. The selection of the lipid phase can serve as a strategy to favor functional and health promoting food products. Both vegetable oils, due to their medium-chain triglycerides content, are not prone to oxidation while it is considered to be excellent for applications involving high temperatures. Thus, initially, the present study focuses on the potential use of extra virgin olive and olive-pomace oil for the preparation of oil-in-water (o/w) nanoemulsions fortified with CLA or CoQ10 and the effect of the oil fraction and emulsifier types on nanoemulsion’s properties were investigated. It was investigated the effect of environment (25 °C) and refrigerated (4 °C) storage on the nanoemulsion physical and chemical stability. Meanwhile, it was established the most stable o/w nanoemulsion system which was used as the dispersed phase for the o1/w/o2nanoemulsions. Moreover, the surface tension characteristics of the non-ionic emulsifiers and their mixture were examined in order to determine the optimum emulsifier concentration for the multiple nanoemulsions. Their stability was investigated under different processing conditions using low and high HLB emulsifiers, and examining different dispersed phases and dispersed phase volume fraction of the primary o/w nanoemulsion. Finally, it was investigated the addition of phenolic compounds, extracted from olive kernel, in the aqueous phase of the o1/w/o2nanoemulsions. The alterations in their physico-chemical properties during storage were examined by monitoring mean droplet diameter (MDD), the emulsion stability index (ESI%), encapsulation efficiency (oiling off% and EE%) bioactive compounds retention, total phenolic content (TPC) and antioxidant radical scavenging (DPPH). The present study explored the potential use of olive-pomace oil for oil-in-water nanoemulsions and compared the effectiveness of EVOO and OPO at nanoemulsion formulations. Concluding, it can be confirmed that o/w nanoemulsions with extra virgin olive and olive-pomace oil and various emulsifiers’ concentrations presented desirable properties, in terms of kinetic stability, droplet size and size distribution (PDI), ζ-potential, viscosity and turbidity. The ternary-phase diagrams were constructed and the o/w nanoemulsions properties were evaluated in relation to their composition. The results showed that it is possible to form OPO nanoemulsions using Tween 20 or Tween 40. EVOO exhibited lower surface and interfacial tension forming nanoemulsions with a high ESI% and a low MDD. However, OPO led to nanoemulsions with a high ESI% but with a higher MDD. It was observed that by increasing the emulsifier concentration the MDD decreased, while increasing the dispersed phase concentration led to a higher MDD and a lower ESI%. Finally, nanoemulsions with the smallest MDD (99.26 ± 4.20 nm) and PDI (0.236 ± 0.010) were formed using Tween 40, which presented lower surface and interfacial tension. Specifically, the nanoemulsion with 6 wt% EVOO and 6 wt% Tween 40 demonstrated an interfacial tension of 51.014 ± 0.919 mN m−1 and with 6 wt% OPO and 8 wt% Tween 20 presented an MDD of 99.26 ± 4.20 nm. However, the nanoemulsion interfacial tension of 54.308 ± 0.089 mN m−1 and an MDD of 340.5 ± 7.1 nm.In addition, CoQ10 nanoemulsions were prepared using extra virgin olive or olive-pomace oil with Tween 20 and Tween 40. The results showed that it is possible to form fine o/w nanoemulsions with the two oils and various emulsifiers’ concentrations. Moreover, both lipid phases resulted in CoQ10-loaded nanoemulsions with high physical and chemical stability under different storage conditions, while extra virgin olive oil further protect CoQ10exhibiting higher retention. All examined conditions led to o/w nanoemulsions with droplet size in the nano range, narrow droplet size distribution, satisfactory droplet charge transparent appearance, and high chemical stability (RCoQ10%). EVOO proved able to form kinetically more stable nanoemulsions with high CoQ10 retention (74.01%), while OPO led to nanosized emulsions with lower CoQ10 retention (71.99%). It was also observed that CoQ10 retention increases as the oil concentration increases (6% w/w EVOO, RCoQ10 = 77.17% and 8% w/w EVOO, RCoQ10 = 79.89%). All the nanoemulsion formulations, after storage either at 4 °C or at 25 °C, remained in the nanosized range after 3 months, with high physical (MDD < 500 nm) and chemical stability (RCoQ10 = 52.87%). Nanoemulsions with 4% w/w emulsifier concentration appeared kinetically and chemically more stable as they presented lower MDD variations during storage. Thus, oil-in-water nanoemulsions are considered excellent delivery systems for CoQ10, offering high protection and controlled release of the bioactive compoundLikewise, oil-in-water nanoemulsions based on extra virgin olive or pomace oil are considered excellent delivery systems offering high protection and controlled release of CLA. All formulations demonstrated good long-term physical and chemical stability; mean droplet diameter less than 300 nm during 60 days-storage (4°C and 25°C). Specifically, CLA degradation (RCLA %) was lower in the nanoemulsions with 8% wt lipid phase; specifically, nanoemulsions with 8% wt olive pomace oil and 6% wt Tween 20 (RCLA=80.154% at 25 oC and RCLA=84.165% 4 oC) after 2 months. Moreover, CLA retention was significantly affected by the type and the ratio of the emulsifier. The retention was higher using 6% wt Tween 40 (73.06%). It should be highlighted that these nanoemulsions with 6% wt emulsifier concentration presented also lower MDD variations during storage. Response surface methodology was used to optimize the preparation conditions (type and concentration of lipid phase and emulsifier) at different storage conditions and predict the optimum values of mean droplet diameter, ζ-potential and CLA retention. The minimum lipid concentration (4% wt) exhibited the optimum values at both environment and refrigerated storage for EVOO nanoemulsions. However, nanoemulsion with 8% wt OPO and 4 % wt Tween 40 (71.843% at 25 oC) or 6% wt Tween 20 were the optimum condition regarding the highest chemical stability. After establishing the optimum conditions for the formation of nanoemulsions with good physical (limited MDD growth) and chemical stability (limited deterioration of the incorporated compounds), the study focused on the preparation of oil-in-water-in-oil (o1/w/o2) multiple nanoemulsions. At the following section, the dispersed phases of the o1/w/o2 nanoemulsions were comparatively evaluated in order to investigate their effect on the particle size (MDD), droplet size distribution (PDI), gravitational phase separation (ESI%), encapsulation (oiling off%, EE%) and chemical stability of the multiple emulsions. Τhe study evaluated the key parameters controlling the stability and functionality of the double nanoemulsions. The surface tension characteristics of the non-ionic emulsifiers (Span 20, Span 80, Tween 20, Tween 40 and Tween 80) and their mixture were examined in order to determine the optimum emulsifier concentration. Oil-in-water-in-oil nanoemulsions were produced with nonionic emulsifiers by combining high speed and ultrasonic homogenizer. The surface activity of the emulsifiers is considered an important parameter, surface tension measurements at air/oil interface can elucidate the surface activity of the non-ionic emulsifiers and thus find their minimum adequate concentration. It was observed that the air/EVOO surface tension was affected by both emulsifier type and its concentration. Generally, the surface tension decreased above concentration 2% wt, however a slight increase was observed over concentration 8% wt. The lowering of the surface tension was greater for the Span 20, particularly at 4% wt; also Span 80 exhibited low ST values at concentration above 4% wt. However, even at lower concentration (1% wt), all emulsifiers reduced the surface tension of bulk EVOO (31.966 ± 0.099 mN/m). Multiple nanoemulsions with desirable properties in terms of particle size, stability, viscosity, encapsulation efficiency and microstructure were obtained by ultrasonic homogenization for 120 -180 s. Most of the double emulsions showed a bimodal particle size distribution, (PDI= 0.471 ± 0.033), regardless of the type and the concentration of the emulsifier used. This appearance is typical for o1/w/o2-type double emulsions prepared with a two-step procedure. The lowest concentrations (1% and 2% wt) of each emulsifier were not very effective as they tend to form big particles. The lowest mean droplet diameter was exhibited in the double emulsions with 6E6T40 (6% wt Tween 40, 6% wt EVOO and 88% wt water) nanoemulsion as a dispersed phase, this dispersed phase presented the lowest droplet size, surface tension and viscosity compared to others. Increasing the dispersed volume fraction, resulted in higher particle size, gravitational separation and high oiling off% values. Regarding the emulsifier type, Span 20, Span 80, Span 80: Tween 20, Span 80: Tween 40 and Span 80: Tween 80 presented the lowest surface tension and facilitated the homogenization resulting in double emulsions with MDD = 528.35 ± 29.10 nm. Respectively, the emulsifiers with high surface tension (Tween 20, Tween 40 and Tween 80) formed double emulsions with proportionally high MDD = 739.92 ± 91.04 nm. Although, no significant differences were observed in the viscosity of the double emulsions, only a slight increase was observed by increasing the emulsifier’s concentration, while the viscosity values of o1/w/o2emulsions processed for t=180 s (89.05 ± 3.15cP) were significantly lower than those processed for t=120 s (92.89 ± 4.03cP). Double nanoemulsions with high viscosity also exhibited high MDD values. The majority of the double emulsions had a transparent appearance with turbidity values varying from 111 NTU to 605 NTU, while several samples were opaque with values higher than 700 NTU. In particular, Span 80 plain and/or in mixture induced lower turbidity values. However, emulsifiers such as Span 80 and Span 80: Tween 40, at 8% wt concentration produced turbid samples (i.e. 8% wt S80:972 NTU, 8% wt S80T40: 559 NTU). As far as the emulsion stability index (ESI%) is concerned after 4 week-storage at 25°C, certain samples with emulsifier Span 20 or Span 80 presented high physical stability without phase separation. However, Tween emulsifiers led to double emulsions with low kinetic stability (ESI%<85%). Moreover, the lower ultrasonic treatment resulted in higher ESI% values, indicating that ESI% and MDD analyses were very consistent. The dispersed phase significantly affected the ESI%. In particular, the double emulsion with the o/w nanoemulsion 8E8T20 (8% wt Tween 20, 8% wt EVOO and 84% wt water) as dispersed phase continuously decreased during storage. However, double emulsions with the nanoemulsion 4E4T20 (4% wt Tween 20, 4% wt EVOO and 92% wt water) or 6E6T40 as dispersed phase presented an appreciable decrease only at the last week of storage.The dispersed volume fractions of the o1/w/o2 nanoemulsions were compared in order to investigate their effect on the particle size, droplet size distribution and gravitational phase separation of the double emulsions. The mean droplet diameter of the double o1/w/o2 emulsions as a function of the volume fraction of o/w nanoemulsions for the different experimental conditions (emulsifier type, ultrasound process time, o/w composition) ranged from 288 nm to 1297 nm. It was found that the highest volume fraction resulted in the largest MDD (851.20 ± 17.15 nm), also, increasing the dispersed phase volume (o1/w) the MDD of double o1/w/o2 emulsions increased. Moreover, the type of dispersed phase (type of o/w nanoemulsion) significantly affected the mean droplet diameter, with the nanoemulsion 6E6T40 resulted to o1/w/o2nanoemulsions presenting the minimum MDD (611.05 ± 22.50 nm). The ultrasonic process time did not significantly influence the MDD, although the combination of higher process time (180 s) and the medium volume fraction (5% wt) of the dispersed phase 6E6T40 resulted in the lowest MDD (447.16 ± 8.42nm). In addition, the emulsifier type significantly affected the droplet size, specifically Span 20 and the mixture Span20/Tween 40 producing double o1/w/o2emulsion with lower MDD (range from 625.27 to 643.20 nm). Surprisingly, it was observed that certain formulations with MDD < 500 nm exhibited high kinetic stability with no phase separation or creaming during storage. However, double emulsions with MDD values near to 0.1μm presented rapidly creaming phenomena and consequently phase separation. Moreover, it was found that the samples with higher emulsifier concentration and dispersed volume fraction had the maximum viscosity values however, their droplet size remained relatively stable in long term with limited phase separation. The examined emulsifiers did not differ significantly in terms of ESI%; double emulsions with Span 20: Tween 40 or Tween 40 presented lower ESI% values. Moreover, it was observed that the double emulsion with the 4E4T20 as inner phase had high ESI% values. Encapsulation efficiency is an important parameter concerning double emulsion, correlating with their droplet size and physical stability. It was found that the concentration of Sudan Red III could not be fully measured on the majority of the double emulsions; indicating that the marker preferentially remained with the inner lipid phase. Regarding the examined conditions, only the dispersed volume fraction affected significantly the recovery of the dyed oil. Specifically, the double emulsion with 4E4T20 as inner phase presenting the lowest oiling off% values. Similar results were observed between the kinetic stability (ESI%) and oiling off% values. The double emulsion with high stability did not present leak of dyed oil phase (o1) in the external phase (o2). The oiling off values above 15%, are consistent with the visual appearance of the double emulsions which exhibited phase separation.In addition, differential scanning calorimetry (DSC) was employed in order to confirm evaluate the encapsulation efficiency and also the complex structure of the double nanoemulsions. The DSC thermographs can give some qualitative information about the droplet size distribution of the inner dispersed phase and the extent of destabilization mechanisms (phase separation). High encapsulation stability yield was observed indicating the successful use of ultrasound to the production of double nanoemulsions. It should be noted that the intensity of the ultrasound did not destroy the double structure of the colloid system. Moreover, it was found that the double nanoemulsions with the low mean droplet diameter presented also low encapsulation yield (EE%). For instance, the sample with a mean droplet diameter of 432 ± 5.15 nm also exhibited EE%= 92.399% and ESI% = 90%. On the other hand, samples with mean droplet diameter of 1155.73 ± 25.19 nm had higher encapsulation yield (EE%= 98.53%) and the ESI% values were 93.3%. The DSC thermograms showed also differences in the structure of the double emulsions. For instance, all the double emulsion which had as a dispersed phase the o/w nanoemulsion 4E4T20 (4% wt Tween 20, 4% wt EVOO and 92% wt water) and those with 3% or 5% wt dispersed phase the nanoemulsion 6E6T40 (6% wt Tween 40, 6% wt EVOO and 88% wt water) showed bimodal distribution with high polydispersity(PDI>0.3). Moreover, the DSC thermograms for all double emulsions with dispersed phase the nanoemulsion8E8T20(8% wt Tween 20, 8% wt EVOO and 84% wt water) and those with high volume fraction (7% wt) of the dispersed phase 6E6T40 had undergone phase separation. In addition, in the current study, multiple o1/w/o2nanoemulsions fortified with CLA or CoQ10 were produced using extra virgin olive or olive pomace oil, and polyphenols from olive kernel were also incorporated in order to enhance their kinetic and chemical stability. All nanoemulsions showed bimodal droplet size distribution, and Newtonian behavior while polyphenols facilitated their homogenization. Droplet size distribution graphs showed bimodal behavior coming in agreement with the high PDI values. It was observed that the CLA-loaded o1/w/o2 nanoemulsions resulted to low MDD (393 ± 13 nm), also the incorporation of polyphenol compounds facilitated the homogenization process lowering further the MDD (335,7 ± 10,9 nm). The size distribution graphs obtained were similar for both vegetable oils, indicating that the differences in droplet size observed in the inner o/w nanoemulsion did not significantly affect the final droplets. The viscosity of the Newtonian multiple nanoemulsions ranged from 74.3 ± 2,4 to 94.3 ± 3,3 cP. The CoQ10-loaded nanoemulsions with OPO presented the lowest viscosity values (74.3 ± 2,4cP). Moreover, it was observed that nanoemulsions with higher viscosity also exhibit a higher MDD (499 ± 15 nm, 91,9 ± 1,3 cP), as their rheological behavior is heavily associated with the droplet size. The addition of polyphenolic compounds contributed to low viscosity values.As far as the kinetic and chemical stability of the sample is concerned, both vegetable oils resulted in samples with high bioactive retention values (>80%) and high ESI% values (>90%) after 30 days storage at 4 oC or 25 oC. Extra virgin olive oil resulted in more stable nanoemulsions in regards to kinetic and chemical stability at 4 oC, showing limited creaming and sedimentation boundary. The droplet size increased significantly during the storage period, with MDD growth being higher during refrigerated (increase > 260 nm) storage than at 25 oC (increase > 150 nm). The ESI% presented similar results to the MDD during storage. After 30 days, the MDD of all samples increased above 500 nm regardless the storage temperature. As far as the retention value is concerned, the concentration of CLA and CoQ10 was significantly decreased during storage. The addition of polyphenols, was proved beneficial lowering the retention value decrease. Moreover, the retention of the bioactive compounds was affected by the storage temperature with the lowest concentration of CLA and CoQ10 recorded at 25 oC after 30 days (R%CLA = 79.2 ± 0.90% and R%CoQ10 = 84,8 ± 4.22%). The reduction of TPC during storage was affected by the type of lipid phase and the incorporation of CLA or CoQ10, as the TPC of EVOO samples fortified with CoQ10 appeared to be more stable after 30 days of storage, regardless the storage temperature. However, the antioxidant activity of o1/w/o2 nanoemulsions was significantly affected by the storage period and temperature, as the DPPH values were more decreased at 25 oC compared to 4 oC after 30 days of storage. Additionally, it was observed that samples with CoQ10 and polyphenols exhibited the highest antioxidant activity even after 30 days. FTIR spectroscopy was used for the characterization of the interactions between the incorporated lipophilic compounds, the polyphenols and the lipid phase on molecular level before or after ultrasound homogenization. The incorporation of CLA or CoQ10 and the presence of polyphenols did not change the infrared spectrum of EVOO or OPO, indicating that no chemical interactions inside the emulsified system. Spectral changes occurred during aging, and led to a significant decrease of the CI (decrease of νC=O intensity at 1744 cm-1) for all samples. Also, FTIR spectra of multiple o1/w/o2nanoemulsions before and after ultrasound homogenization indicated that the sonication process had no significant effect on the composition of the lipid phase, especially in the case of EVOO (decrease of 6.75 ± 0.52%). A significant decrease of the CI was noted in the CLA-loaded o1/w/o2nanoemulsions (decrease of 24.10 ± 1.02%), while CoQ10 proved to protect the lipid phase by increasing the resistance to oxidation (decrease of 13,47 ± 0,67%). Moreover, the addition of polyphenolic compounds enhanced the stability of o1/w/o2nanoemulsion as well, especially in those containing OPO. Finally, the double structure of all the o1/w/o2 formulations was confirmed upon microscopic observation. Confocal scanning laser microscopy (CLSM) was used to visualize the microstructure changes depending on experimental conditions. All o1/w/o2 samples displayed similar structures. The images clearly demonstrated that both aqueous and lipid phases can be differentiated with a satisfying signal-to-noise ratio. The majority of emulsions did not formulate clusters, but they had a broad droplet size distribution. The majority of droplets had entrapped one small lipid droplet, however large spherical or irregular aqueous phases droplets with numerous oil droplets entrapped were also observed. Moreover, a large number of small oil droplets with a narrow size distribution were entrapped within the aqueous droplets. The double o1/w/o2emulsions with Span 20 were coarse and heterogeneous with many large accumulated droplets. Respectively with Tween 40, the structure became more homogeneous and the network was composed of finer spherical. Increasing the dispersed volume fraction, regardless the emulsifier type used, the presence of clusters was more frequent and the o1/w droplets were large. The multiple o1/w/o2 nanoemulsions with OPO were homogeneous and the network was composed of fine spherical droplets. However, EVOO multiple nanoemulsions were coarse and heterogeneous with many large accumulated droplets. Furthermore, the incorporation of CLA or CoQ10 had no significant effect on the structure of the o1/w/o2 multiple nanoemulsions, as no visible differences were observed using CLSM imaging. While the incorporation of polyphenols led to more spherical and homogenous o/w droplets implying that the presence of polyphenols can facilitate homogenization. Therefore, the study reveals that ultrasonic emulsification provides a simple, quick and effective method for the production of multiple o1/w/o2 nanoemulsions using low amounts of emulsifier. In addition, o/w and o1/w/o2nanoemulsions based on extra virgin olive or olive-pomace oil loaded with lipophilic compounds and phenolic extracts can be excellent delivery systems with satisfactory kinetic and chemical stability.

Οι τάσεις των καταναλωτών σήμερα έχουν κατευθύνει τη βιομηχανία προς την ανάπτυξη νέων λειτουργικών τροφίμων εμπλουτισμένων με βιοδραστικά συστατικά, όπως βιταμίνες, φυσικά αντιμικροβιακά και αντιοξειδωτικά συστατικά, φυσικές χρωστικές κ.α. Η νανοτεχνολογία αποτελεί έναν ανερχόμενο κλάδο στην ανάπτυξη τέτοιων συστημάτων μεταφοράς και ενσωμάτωσης βιοδραστικών συστατικών. Με ελεγχόμενο και προσεκτικό σχεδιασμό τα νανογαλακτώματα μπορούν να έχουν μοναδικές φυσικοχημικές ιδιότητες καθιστώντας αυτά ως κατάλληλα συστήματα χορήγησης. Τα τελευταία χρόνια, ο κλάδος της νανοτεχνολογίας τροφίμων έχει στρέψει την προσοχή στη μελέτη και την ανάπτυξη των σύνθετων/διπλών νανογαλακτωμάτων ως καινοτόμα συστήματα ενσωμάτωσης και μεταφοράς επιθυμητών συστατικών. Τα σύνθετα νανογαλακτώματα ελαίου-σε-νερό-σε-έλαιο (ε/ν/ε) είναι πολυφασικά συστήματα που αποτελούνται από ένα νανογαλάκτωμα ελαίου-σε-νερό διεσπαρμένο σε μία συνεχή φάση. Τα συστήματα αυτά παρουσιάζουν διάφορα πλεονεκτήματα ως συστήματα ενσωμάτωσης λόγω της πολυστρωματικής δομής τους, καθώς σε αυτά μπορούν να ενσωματωθούν ταυτόχρονα τόσο λιποδιαλυτές όσο και υδατοδιαλυτές ενώσεις, οι οποίες παράλληλα προστατεύονται από χημική αποικοδόμηση. Παρά τα πιθανά πλεονεκτήματα που παρουσιάζουν στην ανάπτυξη προϊόντων, η παραγωγή σύνθετων νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε είναι περιορισμένη και απαιτείται περαιτέρω μελέτη για τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη τέτοιων κολλοειδών συστημάτων, διερευνώντας τα κατάλληλα συστατικά για τη σύνθεσή τους καθώς και τον αποτελεσματικότερο τρόπο ομογενοποίησης (συσκευή ομογενοποίησης, χρόνος διεργασίας) για την παρασκευή τους. Επιπλέον, παρότι αυτά εμφανίζουν γενικώς αυξημένη κινητική σταθερότητα κατά την αποθήκευση, ανάλογα με τη θερμοκρασία αποθήκευσης μπορεί να μεταβληθούν οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες, με αποτέλεσμα να προκύψει ένα αποσταθεροποιημένο γαλάκτωμα. Γι' αυτό το λόγο απαιτείται εκτενής μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας αποθήκευσης (περιβάλλον, ψύξη) στην κινητική σταθερότητα των διπλών νανογαλακτωμάτων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της ικανότητας του εξαιρετικού παρθένου ελαιόλαδου και του πυρηνέλαιου στον σχηματισμό σύνθετων νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε χρησιμοποιώντας την τεχνική ομογενοποίησης δύο σταδίων συνδυάζοντας τον ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας και τον ομογενοποιητή υπερήχων. Ταυτόχρονα μελετήθηκε η ενσωμάτωση λιπόφιλων (συνένζυμο Q10 (CoQ10) και συζυγές λινελαϊκό οξύ (CLA)) και υδρόφιλων βιοδραστικών συστατικών (εκχύλισμα φαινολικών συστατικών από ελαιοπυρήνα) σε αυτά, επιδιώκοντας τη διερεύνηση των μηχανισμών φυσικής και χημικής αποσταθεροποίησης που διέπουν τα κολλοειδή αυτά συστήματα ενσωμάτωσης κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης στο περιβάλλον ή σε ψύξη. Το μεγάλο ενδιαφέρον της παρούσας ερευνητικής εργασίας για την αξιοποίηση των παραπάνω φυτικών ελαίων αποδίδεται στο γεγονός ότι και τα δύο φυτικά έλαια έχουν υψηλή διατροφική αξία και αξιόλογη περιεκτικότητα σε βιοδραστικά συστατικά, καθώς επίσης θεωρούνται εξαιρετική επιλογή για εφαρμογές που εμπλέκονται με υψηλές θερμοκρασίες επεξεργασίας. Επιπλέον, τα προς μελέτη λιπόφιλα βιοδραστικά συστατικά επιλέχθηκαν με βάση τα διάφορα οφέλη στην υγεία του ανθρώπου που εμφανίζουν και τη μεγάλη υδροφοβικότητα και χημική αστάθεια που παρουσιάζουν, ιδιότητες οι οποίες δημιουργούν την ανάγκη εγκλεισμού και προστασίας τους πριν την εισαγωγή τους στο τρόφιμο. Τέλος, το εκχύλισμα φαινολικών συστατικών που ενσωματώθηκε στα νανογαλακτώματα προέρχεται από τον ελαιοπυρήνα της ελιάς. Η επιλογή αυτή έγινε, διότι τα πολυφαινολικά συστατικά από ελαιοπυρήνα είναι αντίστοιχα με αυτά που βρίσκονται φυσικά στο ελαιόλαδο, και επίσης θεωρούνται εξαιρετικά αντιοξειδωτικά συστατικά, προστατεύοντας αποτελεσματικά τα λιπαρά συστήματα από την οξείδωση. Επίσης, τα συστατικά αυτά αναφέρεται ότι δρουν ως σταθεροποιητές και συν-επιφανειοδραστικά συστατικά στα γαλακτώματα με τελικό αποτέλεσμα να διευκολύνουν την ομογενοποίηση. Τέλος, οι συνθήκες αποθήκευσης αποτέλεσαν σημαντικό κομμάτι της έρευνας καθώς τα συστήματα ενσωμάτωσης με βάση τις κολλοειδείς δομές θα πρέπει να παραμένουν σταθερά με την πάροδο του χρόνου σε διάφορες θερμοκρασίες αποθήκευσης. Αρχικά η διατριβή επικεντρώθηκε στη διερεύνηση των συνθηκών που επηρεάζουν τον σχηματισμό ενός νανογαλακτώματος ε/ν και στην εύρεση των κατάλληλων συνθηκών (συστατικά σύνθεσης) που θα οδηγήσουν σε νανογαλακτώματα ε/ν με μικρή διάμετρο σταγονιδίων, υψηλή κινητική σταθερότητα, δηλαδή αυξημένη αντίσταση στους μηχανισμούς αποσταθεροποίησης και αυξημένο ποσοστό ενσωμάτωσης βιοδραστικού συστατικού. Τα νανογαλακτώματα ε/ν με τα επιθυμητά χαρακτηριστικά αποτέλεσαν την εσωτερική φάση (διεσπαρμένη φάση) του διπλού νανογαλακτώματος ε/ν/ε. Τα νανογαλακτώματα ε/ν παρασκευάστηκαν ακολουθώντας την τεχνική ομογενοποίησης δύο σταδίων, συνδυάζοντας τον ομογενοποίητη υψηλής ταχύτητας και την συσκευή υπερήχων με ρύγχος. Διερευνήθηκαν οι συνθήκες ομογενοποίησης και οι κατάλληλες αναλογίες γαλακτωματοποιητή, υδατικής και λιπαρής φάσης (τριαδικά διαγράμματα φάσης) που μπορούν να οδηγήσουν στην παρασκευή νανογαλακτώματος ε/ν με λιπαρή φάση εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ή πυρηνέλαιο. Μελετήθηκε η επίδραση της λιπαρής φάσης (εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και πυρηνέλαιο), του είδους (Tween 20 και Tween 40) και της συγκέντρωσης του γαλακτωματοποιητή (2%, 4%, 6% και 8% κ.β.) και του κλάσματος όγκου της διεσπαρμένης φάσης (2%, 4%, 6% και 8% κ.β.) στις φυσικοχημικές ιδιότητες των νανογαλακτωμάτων. Η αξιολόγηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων και της κινητικής σταθερότητας των νανογαλακτωμάτων προέκυψε μέσω του προσδιορισμού του μεγέθους και της κατανομής μεγέθους σταγονιδίων, του φορτίου των σταγονιδίων, της εμφάνισης (θολότητα) και του δείκτη σταθερότητας γαλακτώματος (βαρυτικός διαχωρισμός, ESI%) καθώς επίσης και με τη χρήση της Ανάλυσης Κύριων Συνιστωσών (Principal Component Analysis - PCA). Από την κατασκευή των τριαδικών διαγραμμάτων φάσης προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες περιοχές των συγκεντρώσεων νερού, ελαίου και μη ιοντικού γαλακτωματοποιητή (Tween 20 ή Tween 40) που σχηματίζουν νανογαλάκτωμα. Η περιεκτικότητα της λιπαρής φάσης, εντός της νανοπεριοχής, κυμάνθηκε από 1 έως 15% κ.β, ενώ του γαλακτωματοποιητή από 1 έως 40% κ.β. ως προς το συνολικό δείγμα. Τα κολλοειδή συστήματα με περιεκτικότητα λιπαρής φάσης άνω του 30% κ.β. δεν ανήκουν στην κατηγορία του νανογαλακτώματος και παρουσίασαν μεγάλες διακυμάνσεις στις τιμές ιξώδους και στην εμφάνισή τους. Η αύξηση της περιεκτικότητας του γαλακτωματοποιητή αύξησε τα όρια της νανοπεριοχής, παρόλα αυτά συγκεντρώσεις ανώτερες του 42% κ.β. δεν οδήγησαν σε σχηματισμό νανογαλακτωμάτων. Τα αποτελέσματα της επιταχυνόμενης δοκιμής σταθερότητας έδειξαν ότι τα νανογαλακτώματα με λιπαρή φάση εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ή πυρηνέλαιο σε συγκεντρώσεις από 12 έως 14% κ.β. υπέστησαν βαρυτικό διαχωρισμό κατά τη φυγοκέντρηση, ενώ αντιθέτως εκείνα με 10% κ.β. έλαιο παρέμειναν σταθερά. Ωστόσο, τα νανογαλακτώματα με περιεκτικότητα λιπαρού 10% κ.β μετά από 3 κύκλους ψύξης-απόψυξης αποσταθεροποιήθηκαν, αρχικά εμφανίζοντας κρέμα και στη συνέχεια υπέστησαν διαχωρισμό φάσης. Συγκεντρωτικά, τα νανογαλακτώματα με 4-6% κ.β. λιπαρή φάση και 2-6% κ.β. συγκέντρωση γαλακτωματοποιητή ήταν σταθερά έως 12 ημέρες.Ακολούθως για όλες τις εξετασθείσες συνθήκες (4%, 6% και 8% κ.β. λιπαρής φάσης και 2%, 4%, 6% και 8% κ.β. γαλακτωματοποιητή) παρασκευάστηκαν νανογαλακτώματα ε/ν με ικανοποιητική κινητική σταθερότητα, μικρό μέγεθος σταγονιδίων, στενή κατανομή μεγέθους σταγονιδίων, ικανοποιητικό φορτίο σταγονιδίων, χαμηλές τιμές ιξώδους και διαυγή εμφάνιση. Συγκρίνοντας τα δύο φυτικά έλαια ως προς τις φυσικές τους ιδιότητες (επιφανειακή τάση, ιξώδες, δείκτης διάθλασης) και το συνολικό φαινολικό τους περιεχόμενο (ανάλυση HPLC) τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι το χαμηλότερο ιξώδες (67,3 ± 0,2 cP) και η μικρότερη επιφανειακή τάση (30,553 ± 0,010 mN/m) οδηγεί σε νανογαλακτώματα με μικρότερο μέγεθος σταγονιδίων. Τα νανογαλακτώματα ε/ν με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο παρουσίασαν μικρότερο μέγεθος σταγονιδίων (207,4 ± 8,2 nm) και υψηλότερη κινητική σταθερότητα (ESI%: 98%). Ωστόσο και το πυρηνέλαιο αποδείχτηκε κατάλληλη επιλογή ελαίου για τον σχηματισμό νανογαλακτωμάτων ε/ν με υψηλή κινητική σταθερότητα (ESI%: 98,5%), αν και με σταγονίδια μεγαλύτερης διαμέτρου (247,1 ± 6,5 nm). Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι και για τα δύο φυτικά έλαια η αύξηση της συγκέντρωσης της διεσπαρμένης φάσης οδηγεί σε αύξηση του μεγέθους των σταγονιδίων. Όσον αφορά τους εξετασθέντες μη-ιοντικούς γαλακτωματοποιητές (Tween 20 και Tween 40), και οι δύο σχημάτισαν νανογαλακτώματα με υψηλή κινητική σταθερότητα και επιθυμητές ιδιότητες όπως σταγονίδια με μικρή διάμετρο, μικρό εύρος κατανομής μεγέθους, υψηλό φορτίο σταγονιδίων και υψηλή σταθερότητα κατά την αποθήκευση στους 4 oC και 25 oC. Παρά το χαμηλό παραγόμενο φορτίο στη διεπιφάνεια των σταγονιδίων, τα νανογαλακτώματα είτε με Tween 20 είτε με Tween 40 παρέμεναν κινητικά σταθερά για διάστημα 60 έως 90 ημερών στους 4oC και 25oC. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η αύξηση της συγκέντρωσης του γαλακτωματοποιητή οδηγεί στη μείωση της μέσης διαμέτρου σταγονιδίων (208,9 ± 2,3nm για 2% κ.β. συγκέντρωση Tween 20, ενώ 172 ± 3 nm για 4% κ.β. συγκέντρωση Tween 20). Παράλληλα, ο γαλακτωματοποιητής Tween 40 βρέθηκε ότι έχει μεγαλύτερη επιφανειοδραστική ικανότητα (37,103 ± 9,297 mN/m) σε σύγκριση με τον Tween 20 (38,103 ± 9,22 mN/m), διευκολύνοντας έτσι περαιτέρω τον σχηματισμό νανογαλακτωμάτων ελαίου-σε-νερό. Όσον αφορά τις πιθανές συσχετίσεις μεταξύ των ιδιοτήτων των γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ή πυρηνέλαιο και σταθεροποιήθηκαν με Tween 20 ή Tween 40, η ανάλυση κύριων συστατικών έδειξε ότι η μέση διάμετρος σταγονιδίων παρουσιάζει ισχυρή αρνητική συνεισφορά στην πρώτη κύρια συνιστώσα, ενώ το ζ-δυναμικό και το ιξώδες ισχυρή θετική συνεισφορά στη δεύτερη κύρια συνιστώσα. Επιπλέον, ο δείκτης σταθερότητας γαλακτώματος συσχετίζεται αρνητικά με το ζ-δυναμικό. Τέλος, τα εξεταζόμενα νανογαλακτώματα ομαδοποιήθηκαν σε 4 μεγάλες ομάδες. Τα δείγματα της ομάδας α’ εμφάνισαν τις βέλτιστες φυσικοχημικές ιδιότητες, συγκεκριμένα χαμηλότερες τιμές μεγέθους σταγονιδίων και ιξώδους (δείγματα κυρίως με χαμηλή συγκέντρωση εξαιρετικού παρθένου ελαιόλαδου), ενώ τα δείγματα της ομάδας γ’ παρουσίασαν υψηλές τιμές μεγέθους σταγονιδίων και ιξώδους (δείγματα με υψηλή συγκέντρωση γαλακτωματοποιητή Tween 20 ή Tween 40). Επιπλέον, όλα τα δείγματα της ομάδας δ’ φάνηκε να έχουν την ελάχιστη κινητική σταθερότητα και τις μικρότερες απόλυτες τιμές ζ-δυναμικού (δείγματα κυρίως με πυρηνέλαιο και με υψηλότερη συγκέντρωση γαλακτωματοποιητή), ενώ τα δείγματα της ομάδας β’ παρουσίασαν υψηλές απόλυτες τιμές ζ-δυναμικού (δείγματα κυρίως με χαμηλή συγκέντρωση γαλακτωματοποιητή). Στη συνέχεια, εξετάστηκε η επίδραση της ενσωμάτωσης του συνένζυμου Q10 (6% κ.β. ως προς τη λιπαρή φάση) και του συζυγούς λινελαϊκού οξέος (6% κ.β. ως προς τη λιπαρή φάση) στις φυσικοχημικές ιδιότητες των νανογαλακτωμάτων καθώς επίσης μελετήθηκε η κινητική και χημική σταθερότητα αυτών των κολλοειδών συστημάτων. Μελετήθηκε η επίδραση της λιπαρής φάσης (εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και πυρηνέλαιο), του είδους (Tween 20 και Tween 40) και της συγκέντρωσης του γαλακτωματοποιητή (4%, 6%, 8% και 10% κ.β.), του κλάσματος όγκου της διεσπαρμένης φάσης (4%, 6%, 8% και 10% κ.β) και των συνθηκών αποθήκευσης (60-90 ημέρες στους 4 οC και 25 οC) στις φυσικοχημικές ιδιότητες των νανογαλακτωμάτων. Η αξιολόγηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων, της κινητικής και χημικής σταθερότητας των νανογαλακτωμάτων προέκυψε μέσω του προσδιορισμού του μεγέθους και της κατανομής μεγέθους σταγονιδίων, του φορτίου των σταγονιδίων, της εμφάνισης (θολότητα), της μεταβολής του μεγέθους και του φορτίου των σταγονιδίων καθώς και της μείωσης του ποσοστού διατήρησης του ενσωματωμένου βιοδραστικού συστατικού κατά την αποθήκευση στους 4 οC και 25 οC. Για τα εμπλουτισμένα νανογαλακτώματα με συνένζυμο Q10 (CoQ10) πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της επίδρασης των συνθηκών ομογενοποίησης στις φυσικοχημικές ιδιότητες των νανογαλακτωμάτων μέσω Ανάλυσης Ομαδοποίησης (Cluster Analysis). Ενώ για τα εμπλουτισμένα νανογαλακτώματα με συζυγές λινελαϊκό οξύ (CLA) πραγματοποιήθηκε αριστοποίηση των συνθηκών διεργασίας μέσω μεθοδολογίας Αποκριτικών Επιφανειών (Response Surface Methodology, RSM). Πραγματοποιήθηκε επιτυχής ενσωμάτωση του συνένζυμου Q10 στα νανογαλακτώματα ελαίου-σε-νερό χρησιμοποιώντας είτε εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο είτε πυρηνέλαιο και μη ιονικούς γαλακτωματοποιητές. Όλες οι εξετασθείσες πειραματικές συνθήκες κατέληξαν στον σχηματισμό νανογαλακτωμάτων με μέση διάμετρο σταγονιδίων μικρότερη από 500 nm κατά τη διάρκεια αποθήκευσης 90 ημερών στους 4 °C και 25 °C. Από την άποψη της χημικής σταθερότητας, η παρουσία του ενσωματωμένου CoQ10 επιβεβαιώθηκε μετά από αποθήκευση 3 μηνών, με ποσοστό διατήρησης 52,87% και στις δύο θερμοκρασίες αποθήκευσης (4 °C, 25 °C). Το ποσοστό διατήρησης ήταν υψηλότερο στα νανογαλακτώματα με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, πιο συγκεκριμένα τα νανογαλακτώματα με 6% και 8% κ.β. διεσπαρμένη φάση εμφάνισαν τα υψηλότερη ποσοστά διατήρησης, 77,17 ± 1,53% και 79,89 ± 1,33%, αντίστοιχα μετά από 3 μήνες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της κινητικής και χημικής σταθερότητας, τα νανογαλακτώματα μπορούν να θεωρηθούν ως άριστα συστήματα ενσωμάτωσης και μεταφοράς του CoQ10, καθώς όλα τα δείγματα εμφάνισαν ικανοποιητική μακροπρόθεσμη φυσική και χημική σταθερότητα. Τα δεδομένα που προέκυψαν αναλύθηκαν με τη στατιστική μέθοδο Ανάλυσης Ομαδοποίησης (Cluster Analysis) και τα δείγματα διακρίθηκαν δύο κύριες ομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει όλα τα δείγματα με χαμηλές τιμές μεγέθους σταγονιδίων (103 ± 5 - 195,4 ± 3,3 nm), θολότητας και ποσοστού διατήρησης CoQ10 (41,45 ± 1,5-73,98 ± 2,34%) και υψηλές τιμές απόλυτου ζ-δυναμικού. Τα δείγματα αυτά χαρακτηρίζονται κυρίως από χαμηλή συγκέντρωση ελαίου και Tween 40. Η δεύτερη ομάδα περιλαμβάνει δείγματα που παρουσιάζουν υψηλές τιμές μεγέθους σταγονιδίων (208 ± 4 – 319 ± 9 nm), θολότητας και ποσοστού διατήρησης CoQ10 (42,46 ± 1,36% έως 80,11 ± 1,99%), αλλά χαμηλές τιμές απόλυτου ζ-δυναμικού. Τα δείγματα αυτά χαρακτηρίζονται κυρίως από υψηλή συγκέντρωση ελαίου και Tween 20. Όσον αφορά την ενσωμάτωση του CLA, τα αποτελέσματα της μελέτης ήταν παρόμοια και εξίσου ικανοποιητικά όπως και του CoQ10, καθώς όλα τα εμπλουτισμένα νανογαλακτώματα παρουσίασαν καλή μακροχρόνια φυσική και χημική σταθερότητα και διαυγή εμφάνιση κατά την αποθήκευση στους 4 °C και 25 °C για διάρκεια 60 ημερών. Όλα τα νανογαλακτώματα είχαν μέγεθος σταγονιδίων μικρότερο από 300 nm μετά το πέρας της αποθήκευσης και στις δύο θερμοκρασίες. Η διατήρηση του ενσωματωμένου CLA ήταν υψηλότερη στα νανογαλακτώματα με λιπαρή φάση το πυρηνέλαιο και κυρίως σε θερμοκρασία ψύξης. Συγκεκριμένα, νανογαλακτώματα πυρηνέλαιου με 6% κ.β. Tween 20 παρουσίασαν το υψηλότερο ποσοστό διατήρησης CLA (80,154% στους 25 oC και 84,165% 4 oC) μετά από 2 μήνες. Τα δείγματα με τη μικρότερη συγκέντρωση γαλακτωματοποιητή εμφάνισαν καλύτερη κινητική σταθερότητα, δηλαδή τη μικρότερη αύξηση διαμέτρου η οποία κυμάνθηκε από 10,2 έως 18,85 nm και βέλτιστη χημική σταθερότητα με τα μεγαλύτερα ποσοστά διατήρησης CLA (61,88 ± 3,12%). Επιπλέον, τα ποσοστά διατήρησης του ενσωματωμένου CLA ήταν υψηλότερα (75,09 ± 2,13%) στα νανογαλακτώματα με 8% κ.β. λιπαρή φάση. Παρατηρήθηκε, συνεπώς, ότι η κινητική σταθερότητα των νανογαλακτωμάτων συμπίπτει με τη χημική τους σταθερότητα. Με βάση το μοντέλο παλινδρόμησης που αναπτύχθηκε οι βέλτιστες συνθήκες που βρέθηκαν είναι οι εξής: για νανογαλακτώματα με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, η ελάχιστη συγκέντρωση (4% κ.β.) λιπαρής φάσης επέδειξε βέλτιστες τιμές μέσου μεγέθους σταγονιδίων (80,122 ± 4,22 nm στους 25 oC και 99,043 ± 1,089 στους 4 oC) και απόλυτου ζ-δυναμικού (-8,225 ± -1,500 mV στους 25oC και -10,43 ± -1,63mV στους 4 oC), καθώς και τα βέλτιστα ποσοστά διατήρησης CLA (73,065 ± 5,020% στους 25 oC για 3% κ.β Tween 40 και 61,879 ± 4,129% στους 4 oC για 5% κ.β Tween 40). Η βέλτιστη συγκέντρωση ελαίου για τα νανογαλακτώματα με πυρηνέλαιο ήταν το 5% ή το 6% κ.β. για τις ιδιότητες του μεγέθους (122,24 ± 3,2 nm στους 25 oC και 119,24 ± 5,06 nm στους 4 oC, με 4% κ.β. Tween 40) και του φορτίου των σταγονιδίων (-8,404 ± -0,922 mV στους 25 oC και -8,939 ± -0,989 mV στους 4 oC, με 6% κ.β. Tween 40), ενώ οι βέλτιστες συνθήκες για τη διατήρηση του CLA ήταν: 8% κ.β. έλαιο με 4% κ.β. Tween 40 (72,243 ± 2,543% στους 25 oC) ή 6% κ.β. Tween 20 (85,942 ± 1,002, στους 4 oC). Επίσης, η προσθήκη φαινολικών συστατικών από ελαιοπυρήνα στην υδατική φάση του νανογαλακτώματος ε/ν αποδείχτηκε ευεργετική για τον σχηματισμό τους, μειώνοντας τη διάμετρο των σταγονιδίων (μείωση κατά 12,06 nm). Στη συνέχεια η παρούσα διατριβή εστίασε στη μελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν τη δομή και σταθερότητα των διπλών νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν ακολουθώντας την τεχνική ομογενοποίησης δύο σταδίων. Αρχικά σχηματίστηκε το νανογαλάκτωμα ε/ν το οποίο ομογενοποιήθηκε με την εξωτερική λιπαρή φάση με την χρήση ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας. Το πρώιμο σύνθετο γαλάκτωμα ε/ν/ε ομογενοποιήθηκε εκ νέου με ομογενοποιητή υπερήχων. Διερευνήθηκε, λοιπόν, η επίδραση του χρόνου ομογενοποίησης (χρόνος υπερήχων 120 s και 180 s), της σύστασης του εσωτερικού νανογαλακτώματος ε/ν (νανογαλάκτωμα ε/ν με 4% κ.β. λιπαρή διεσπαρμένη φάση και 4% Tween 20, νανογαλάκτωμα ε/ν με 6% κ.β. λιπαρή διεσπαρμένη φάση και 6% κ.β Tween 40, και νανογαλάκτωμα ε/ν με 8% κ.β λιπαρή διεσπαρμένη φάση και 8% κ.β Tween 20) και του κλάσματος όγκου της διεσπαρμένης φάσης (3%, 5% και 7% περιεκτικότητα εσωτερικού νανογαλακτώματος νανογαλάκτωμα ε/ν). Επιπλέον, μελετήθηκε η επιφανειοδραστική ικανότητα των γαλακτωματοποιητών Tween 20, Tween 40, Tween 80, Span 20 και Span 80, μετρώντας την επιφανειακή τάση συναρτήσει της συγκέντρωσής τους. Προσδιορίστηκαν οι μεταβολές στις φυσικοχημικές ιδιότητες (μέση διάμετρος σταγονιδίων, μορφή διασποράς, απεικόνιση δομής, θολότητα, δείκτης διάθλασης, ιξώδες, ποσοστό ενσωμάτωσης (oiling off%, EE%)), καθώς και η κινητική σταθερότητα κατά την αποθήκευση σε συνθήκες περιβάλλοντος συναρτήσει των πειραματικών συνθηκών. Παρατηρήθηκε ότι η ομογενοποίηση με υπέρηχους με ρύγχος με διάρκεια επεξεργασίας 120 s ή 180s αποτελεί μία αποτελεσματική μέθοδο για την παραγωγή πολλαπλών νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε χρησιμοποιώντας χαμηλές ποσότητες γαλακτωματοποιητή (1% έως 8% κ.β.). Η πλειοψηφία των δειγμάτων εμφάνισε μικρό μέγεθος σταγονιδίων (288 ± 7,5 έως 506,32 ± 10,16 nm), διαφανή ή ημιδιαφανή εμφάνιση (111 ± 9 έως 506 ± 12 NTU), αυξημένη κινητική σταθερότητα (ESI% >87 ± 1,5%) και ικανοποιητικά ποσοστά ενσωμάτωσης (oiling off < 12±0,65% και ΕΕ% > 82±2,5%). Και για τους δύο χρόνους διεργασίας παρασκευάστηκαν διπλά νανογαλακτώματα με παρόμοια χαρακτηριστικά όσον αφορά το μέγεθος των σωματιδίων (για t=120 s μέση διάμετρος σταγονιδίων 573,69 ± 11,23nm, 616,62 ± 89,28nm αντίστοιχα για t=180 s), τη σταθερότητα (80 ± 2,84% και 93 ± 2,48%, αντίστοιχα), το ιξώδες και τη μικροδομή τους. Ωστόσο, παρατηρήθηκε μια μικρή μείωση του ιξώδους στα δείγματα που είχαν ομογενοποιηθεί με μεγαλύτερο χρόνο επεξεργασίας, για t = 180 s ιξώδες 89,05 ± 3,15 cP ενώ για t = 120 s ιξώδες 92,89 ± 4,03 cP. Επιπλέον, όλοι οι εξετασθέντες μη ιοντικοί γαλακτωματοποιητές και τα μίγματά τους (Span 20, Span 80, Tween 20, Tween 40, Tween 80) αποδείχθηκε ότι μπορούν να παράγουν διπλά νανογαλακτώματα ελαίου-σε-νερό-σε-έλαιο με ικανοποιητικό μέγεθος σταγονιδίων, θολότητα και κινητική σταθερότητα. Διαπιστώθηκε, ωστόσο ότι οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις (1% και 2% κ.β.) των γαλακτωματοποιητών δεν ήταν πολύ αποτελεσματικές καθώς σχημάτισαν σταγονίδια μεγάλης διαμέτρου (από 544,23 ± 8,63 nm έως 891,7 ± 11,3 nm). Όλα τα διπλά γαλακτώματα έδειξαν ευρεία κατανομή μεγέθους σταγονιδίων (δείκτης πολυδιασποράς: 0,471), ανεξάρτητα από τον τύπο και τη συγκέντρωση του χρησιμοποιούμενου γαλακτωματοποιητή. Οι γαλακτωματοποιητές με χαμηλή επιφανειακή τάση (26,849 ± 0,104 mN/m, 27,643 ± 0,065 mN/m), κυρίως οι Span 20, Span 80, σχημάτισαν διπλά γαλακτώματα με διάμετρο μικρότερη από τα 500 nm. Αντίστοιχα, οι γαλακτωματοποιητές με υψηλή επιφανειακή τάση (31,953±0,013 mN/m) σχημάτισαν διπλά γαλακτώματα με αυξημένες τιμές διαμέτρου (739,92 ± 91,04 nm) και θολή εμφάνιση, καθώς και χαμηλή κινητική σταθερότητα (ESI% <85%). Oι πιο υδρόφιλοι γαλακτωματοποιητές (Tween 20, Tween 40, Tween 80) σχημάτισαν διπλά νανογαλακτώματα ε/ν/ε με αυξημένη διάμετρο σταγονιδίων (585,1 ± 81,52 nm) και περιορισμένη σταθερότητα (δείκτης σταθερότητας <80%), η χρήση μίγματος λιπόφιλων και υδρόφιλων γαλακτωματοποιητών (Span, Tween) έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα και ως προς το μέγεθος των σταγονιδίων (557,21 ± 83,47 nm) και τη θολότητα/εμφάνιση καθώς και ως προς την κινητική τους σταθερότητα (ESI% >85%). Εκτός από το είδος του γαλακτωματοποιητή, και το είδος της διεσπαρμένης φάσης (αρχικό νανογαλάκτωμα) επηρέασε σημαντικά τη μέση διάμετρο σταγονιδίων του σύνθετου νανογαλακτώματος, καθώς όσο μικρότερα είναι τα σταγονίδια του αρχικού νανογαλακτώματος, τόσο μικρότερα σταγονίδια σχηματίστηκαν κατά τον σχηματισμό του διπλού γαλακτώματος. Πιο συγκεκριμένα, όταν χρησιμοποιήθηκε ως διεσπαρμένη φάσης το νανογαλάκτωμα ε/ν με τη μικρότερη επιφανειακή τάση (33,526 ± 0,150 mN/m), διάμετρο σταγονιδίων (124,2 ± 2,013 nm) και το μικρότερο ιξώδες (3,9 ± 0,3cP), δηλαδή το νανογαλάκτωμα ε/ν με 6% κ.β εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και 6% κ.β Tween 40, σχηματίστηκαν διπλά νανογαλακτώματα ε/ν/ε με μικρότερη διάμετρο (εύρος από 300,0 ± 9,5 έως 613,0 ± 12,9nm) και λιγότερο θολή εμφάνιση. Αντιθέτως το νανογαλάκτωμα ε/ν με 8% κ.β. εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο το οποίο είχε και τη μεγαλύτερη επιφανειακή τάση (34,843 ± 0,252 mN/m), διάμετρο σταγονιδίων (235,62 ± 1,53nm) και το μεγαλύτερο ιξώδες (4,70 ± 0,1 cP), οδήγησε σε διπλά γαλακτώματα με τη μεγαλύτερη διάμετρο σταγονιδίων με εύρος που κυμαινόταν από 487 ± 17 έως 1200 ± 22nm. Επιπλέον, όσον αφορά την επίδραση του κλάσματος όγκου της διεσπαρμένης φάσης, παρατηρήθηκε ότι καθώς αυξάνεται ο όγκος της διεσπαρμένης φάσης από 3% κ.β. σε 7% κ.β. αυξάνεται επίσης το μέγεθος των σταγονιδίων. Η τιμή μέσης διαμέτρου των διπλών γαλακτωμάτων κυμάνθηκε από 288 ± 4 nm έως 1297,3 ± 9,13 nm. Τα δείγματα με το μεγαλύτερο κλάσμα όγκου διεσπαρμένης φάσης (7% κ.β) εμφάνισαν μέσο μέγεθος σταγονιδίων μεγαλύτερο από τα 500 nm. Για παράδειγμα με κλάσμα όγκου διεσπαρμένης φάσης 3% κ.β. (εσωτερικό νανογαλάκτωμα ε/ν) η μέση διάμετρος του διπλού νανογαλακτώματος ήταν 487 ± 12 nm, ενώ όταν το κλάσμα όγκου αυξήθηκε στο 7% κ.β. η μέση διάμετρος των σταγονιδίων ήταν 1297,3 ± 9,13nm. Ο χρόνος επεξεργασίας με υπέρηχους δεν επηρέασε σημαντικά το μέγεθος των σταγονιδίων, για παράδειγμα για το διπλό γαλάκτωμα με 5% κ.β. κλάσμα όγκου διεσπαρμένης φάσης η μέση διάμετρος των σταγονιδίων ήταν 689 ± 9 nm για t=120 s, ενώ 636 ± 12nm για t=180 s. Ωστόσο, ο συνδυασμός του μεγαλύτερου χρόνου διεργασίας (180 s) και της μέσης τιμής κλάσματος όγκου διεσπαρμένης φάσης (5% κ.β.) είχε ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό διπλών γαλακτωμάτων με τη μικρότερη τιμή μέσης διαμέτρου σταγονιδίων (447,16 ± 21,4nm). Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι, τα δείγματα με 2% κ.β. γαλακτωματοποιητή Tween 40 και με το υψηλότερο κλάσμα όγκου διεσπαρμένης φάσης (7% κ.β.) είχαν τις μεγαλύτερες τιμές ιξώδους (από 75 ± 2,5 έως 81 ± 3cP) και μεγαλύτερες τιμές διαμέτρου σταγονιδίων (από 819 ± 7,5 έως 1297,3 ± 9,13nm), τα οποία όμως παρέμειναν σταθερά κατά την αποθήκευση. Επίσης, και εδώ το μίγμα λιπόφιλων και υδρόφιλων γαλακτωματοποιητών (Span 20, Tween 40) έδωσε πολύ καλά αποτελέσματα ως προς το μέγεθος των σταγονιδίων (από 625,27 ± 8,7έως 643,20 ± 11,6nm) και το δείκτη σταθερότητας (από 82% έως 93,7%), ακόμη και για τα δείγματα με το μεγαλύτερο κλάσμα όγκου διεσπαρμένης φάσης (7% κ.β.). Παράλληλα, όσον αφορά την αποτελεσματικότητα των διπλών νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε ως συστήματα ενσωμάτωσης, παρατηρήθηκαν παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα της κινητικής σταθερότητας (oiling off%, διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης (DSC). Δηλαδή τα δείγματα με υψηλή κινητική σταθερότητα (δείκτης γαλακτώματος > 85%) δεν παρουσίασαν διαρροή της εσωτερικής χρωματισμένης λιπαρής φάσης στην εξωτερική. Το κλάσμα όγκου της διεσπαρμένης φάσης επηρέασε σημαντικά το ποσοστό διαχωρισμού της χρωματισμένης λιπαρής φάσης (oiling off%). Το διπλό γαλάκτωμα που είχε ως εσωτερική φάση το νανογαλάκτωμα με 4% κ.β. έλαιο παρουσίασε το μικρότερο ποσοστό διαχωρισμού της λιπαρής φάσης, λιγότερο από 10%. Αντίστοιχα τα δείγματα με ποσοστά διαχωρισμού άνω του 15%, εμφάνισαν και μειωμένη κινητική σταθερότητα με δείκτη σταθερότητας κάτω από 80%. Επιπρόσθετα, μέσω της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης επιβεβαιώθηκε η διπλή δομή του συστήματος, προσδιορίστηκε η ικανότητα ενσωμάτωσής του καθώς και εξηγήθηκαν τα φαινόμενα αποσταθεροποίησης (διαχωρισμός φάσης). Tα υψηλά ποσοστά ενσωμάτωσης φανερώνουν την επιτυχημένη χρήση των υπερήχων για τον σχηματισμό διπλών νανογαλακτωμάτων, καθώς η ένταση των υπερήχων δεν κατέστρεψε τη διπλή δομή του συστήματος, απλά μείωσε τη διάμετρο των σταγονιδίων. Διαπιστώθηκε ότι οι χαμηλότερες τιμές ενσωμάτωσης (EE%) σχετίζονται με τις χαμηλότερες τιμές μεγέθους σταγονιδίων. Για παράδειγμα το διπλό γαλάκτωμα με μέση διάμετρο σταγονιδίων 432 ± 8 nm εμφάνισε απόδοση ενσωμάτωσης (ΕΕ%) 92,4 ± 1,8% και δείκτη σταθερότητας γαλακτώματος 90%. Αντιθέτως το δείγμα με μέση διάμετρο σταγονιδίων 1155,73 ± 29,33nm εμφάνισε απόδοση ενσωμάτωσης (ΕΕ%) 98,53 ± 2,69% και δείκτη σταθερότητας γαλακτώματος 93,3%. Επιπλέον, από το θερμογράφημα παρατηρήθηκε ότι τα σύνθετα γαλακτώματα με εσωτερική φάση το νανογαλακτώματα με 4% κ.β. εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και τα διπλά νανογαλακτώματα με 3% και 5% κ.β. διεσπαρμένη φάση, το νανογαλάκτωμα με 6% κ.β εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο είχαν μεγάλο δείκτη πολυδιασποράς (δείκτης πολυδιασποράς > 0,3), δηλαδή μεγάλο εύρος κατανομής μεγέθους σταγονιδίων. Επίσης, παρατηρήθηκε από τα θερμογραφήματα ότι όλα τα διπλά γαλακτώματα με εσωτερική φάση το νανογαλακτώματα με 8% κ.β. εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και εκείνα με 7% κ.β. διεσπαρμένη φάση το νανογαλάκτωμα με 6% κ.β. εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο είχαν υποστεί διαχωρισμό φάσηςΤέλος, η μελέτη εστίασε στην αξιολόγηση της κινητικής και χημικής σταθερότητας των σύνθετων νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε εμπλουτισμένων με συζυγές λινελαϊκό οξύ ή με συνένζυμο Q10, με λιπαρή φάση εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ή πυρηνέλαιο. Μελετήθηκε η επίδραση της λιπαρής φάσης και του είδους του βιοδραστικού συστατικού, και αξιολογήθηκε η ικανότητα του πυρηνέλαιου στον σχηματισμό διπλών νανογαλακτωμάτων με υψηλή κινητική και χημική σταθερότητα. Επιπλέον, διερευνήθηκε η απόδοση ενσωμάτωσης και η προστασία των ενσωματούμενων βιοδραστικών συστατικών, για το λόγο αυτό στην εσωτερική υδατική φάση του διπλού νανογαλακτώματος προστέθηκαν εκχύλισμα φαινολικών συστατικών από ελαιοπυρήνα. Στόχος ήταν η ενίσχυση της κινητικής και χημικής σταθερότητας των δειγμάτων, διότι τα συστατικά αυτά εμφανίζουν αντιοξειδωτική και επιφανειοδραστική δράση, καθώς και η μελέτη της επίδρασής τους στις φυσικοχημικές ιδιότητες της σύνθετης κολλοειδούς δομής. Μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες (μέγεθος σταγονιδίων, κατανομή μεγέθους, εμφάνιση/θολότητα), καθώς και η κινητική (μεταβολή μεγέθους σταγονιδίων, δείκτης σταθερότητας γαλακτώματος) και η χημική σταθερότητα (διατήρηση ενσωματωμένου βιοδραστικού συστατικού, μεταβολή συνολικού φαινολικού περιεχομένου και αντιοξειδωτικής ικανότητας, αξιολόγηση δομής μέσω FTIR) κατά την αποθήκευση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και σε ψύξη (4 oC και 25 oC).Όσον αφορά τα διπλά νανογαλακτώματα, και τα δύο φυτικά έλαια έδειξαν παρόμοια αποτελέσματα, οδηγώντας στα σύνθετα κολλοειδή συστήματα με ικανοποιητική διάμετρο σταγονιδίων (355,7 ± 15,3 nm έως 499 ± 21 nm) και αυξημένη σταθερότητα (ESI% > 90%). Τα σύνθετα νανογαλακτώματα με εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο εμφάνισαν μικρότερη τιμή μέσης διαμέτρου σταγονιδίου (335 ± 11,50 έως 477 ± 11nm) σε σχέση με εκείνα με πυρηνέλαιο (490 ± 19 έως 499 ± 13,5 nm). Ωστόσο, τα δείγματα με πυρηνέλαιο εμφάνισαν μικρότερο εύρος κατανομής μεγέθους (δείκτης πολυδιασποράς, 0,274 ± 0,042 έως 0,294 ± 0,008). Επιπλέον, η προσθήκη φαινολικών ενώσεων μείωσε, εκτός από το μέγεθος των σταγονιδίων (από 393 ± 13 nm σε 335 ± 11,50 nm), και το ιξώδες (από 81,7 ± 2,7 cP σε 79,5 ± 3,0 cP). Παρατηρήθηκε ότι η ταυτόχρονη ενσωμάτωση CLA και φαινολικών συστατικών διευκόλυνε τη διαδικασία ομογενοποίησης, οδηγώντας σε διπλά νανογαλακτώματα με μικρότερη διάμετρο σταγονιδίων (335,0 ± 11,50 nm). Κατά την αποθήκευση, μετά από 30 ημέρες, τα πολλαπλά νανογαλακτώματα με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο φάνηκε να είναι πιο σταθερά, δείχνοντας ελάχιστη αύξηση της διαμέτρου των σταγονιδίων (αύξηση μεγέθους κατά 91,61 nm, ενώ αύξηση μεγέθους κατά 119,42 nm για το πυρηνέλαιο). Ωστόσο, η διάμετρος σταγονιδίων όλων των δειγμάτων αυξήθηκε πάνω από 500 nm ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία αποθήκευσης (4 oC και 25 oC). Ο δείκτης σταθερότητας γαλακτώματος, δηλαδή οι αλλαγές στην οπτική εμφάνιση των δειγμάτων (ίζημα, κρέμα) παρουσίασε παρόμοια αποτελέσματα με την αύξηση του μεγέθους των σταγονιδίων κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Πιο συγκεκριμένα, ο διαχωρισμός φάσης ήταν μικρότερος στα διπλά νανογαλακτώματα με σταγονίδια μικρότερου μεγέθους σταγονιδίων. Στα πλαίσια της αξιολόγησης της χημικής σταθερότητας των διπλών νανογαλακτωμάτων και της αποτελεσματικότητάς τους ως συστήματα ενσωμάτωσης και μεταφοράς, τα αποτελέσματα ήταν ικανοποιητικά. Τόσο το ενσωματωμένο CLA όσο και το CoQ10 διατηρήθηκαν σε υψηλά ποσοστά στα νανογαλακτώματα ελαίου-σε-νερό-σε-έλαιο, το ποσοστό διατήρησης και για τα δύο βιοδραστικά συστατικά κυμαινόταν από 77 ± 1,5% έως 89 ± 3% μετά από 30 ημέρες στους 4 oC και 25 oC. Τέλος, παρατηρήθηκε ότι τα δείγματα με χαμηλή αρχική μέση διάμετρο σταγονιδίων (335,7 ± 15,3 nm) έδειξαν υψηλή σταθερότητα (ESI%= 91,7 ± 0,5%) κατά την αποθήκευση καθώς και υψηλές τιμές διατήρησης των ενσωματωμένων βιοδραστικών συστατικών (80,89 ± 1,3%). Παράλληλα, η προσθήκη φαινολικών ενώσεων στη υδατική φάση του σύνθετου γαλακτώματος ε/ν/ε ενίσχυσε τη σταθερότητα των διπλών νανογαλακτωμάτων. Τα διπλά νανογαλακτώματα με βάση το πυρηνέλαιο εμφάνισαν ικανοποιητική χημική σταθερότητα καθώς η διατήρηση του βιοδραστικού συστατικού κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης ήταν πάνω από 90 ± 2% για τους 25 oC και πάνω από 93,1 ± 1,5% για τους 4 oC. Επίσης παρατηρήθηκε ότι το συνολικό φαινολικό περιεχόμενο των νανογαλακτωμάτων εμπλουτισμένων με CoQ10 με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ήταν σταθερό μετά από 30 ημέρες (0,20 mg GAE/ g γαλακτώματος), ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία αποθήκευσης. Ωστόσο, η αντιοξειδωτική ικανότητα των διπλών νανογαλακτωμάτων (0,108 mg Trolox/ g γαλακτώματος) μειώθηκε περισσότερο στους 25 oC σε σύγκριση με τους 4 oC (0,124 mg Trolox/ g γαλακτώματος) μετά από 30 ημέρες αποθήκευσης. Στη συνέχεια, στα πλαίσια της διερεύνησης της ικανότητας του ομογενοποιητή υπερήχων στον σχηματισμό διπλών νανογαλακτωμάτων μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις σε μοριακό επίπεδο μεταξύ των ενσωματωμένων λιπόφιλων βιοδραστικών συστατικών καθώς και της επίδρασης της ομογενοποίησης με υπέρηχους. Η χρήση της φασματοσκοπίας υπερύθρου (FTIR) αποδείχτηκε μία ταχεία και αποτελεσματική μέθοδος η οποία προσδιόρισε την επίδραση των υπερήχων στη χημική σταθερότητα των δειγμάτων. Τα φάσματα FTIR έδειξαν ότι η διαδικασία υπερήχων δεν αλλοίωσε σημαντικά τη σύσταση της λιπαρής φάσης, κυρίως στα δείγματα που είχαν ως βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο. Παρατηρήθηκε όμως, ότι ο δείκτης καρβονυλίου (CI) μειώθηκε σημαντικά κατά την αποθήκευση των γαλακτωμάτων στους 25 °C. Ωστόσο, τόσο η προσθήκη φαινολικών συστατικών όσο και η ενσωμάτωση του CoQ10 προστάτεψε τη λιπαρή φάση έναντι της οξείδωσης, ειδικά στα δείγματα με βάση το πυρηνέλαιο. Ο δείκτης CI για τα διπλά νανογαλακτώματα εμπλουτισμένα με CoQ10 με βάση το πυρηνέλαιο μειώθηκε περίπου κατά 13,47 ± 0,67%, ενώ για τα αντίστοιχα δείγματα με CLA μειώθηκε περίπου κατά 24,10% ± 1,02, όμως πρέπει να σημειωθεί ότι για τα διπλά νανογαλακτώματα εμπλουτισμένα με CoQ10 με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ο δείκτης CI κατά την αποθήκευση μειώθηκε περίπου κατά 6,78% ± 0,52. Συγκεντρωτικά όσον αφορά την απεικόνιση της μικροδομής των διπλών νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε, η σύνθετη δομή τους επιβεβαιώθηκε με τη χρήση συνεστιακού ανάστροφου μικροσκοπίου σάρωσης με λέιζερ (CLSM). Η χρήση του μικροσκοπίου έδειξε ότι η υδατική και η λιπαρή φάση διαφοροποιούνται και απεικονίζονται με σαφήνεια. Η πλειονότητα των γαλακτωμάτων δεν εμφάνισε συστάδες, ωστόσο είχε ευρεία κατανομή μεγέθους σταγονιδίων. Όλα τα δείγματα εμφάνισαν παρόμοιες δομές, με την πλειονότητα των σταγονιδίων να έχουν παγιδεύσει ένα μικρό σταγονίδιο ελαίου. Ωστόσο παρατηρήθηκαν επίσης μεγάλα σφαιρικά ή ακανόνιστα σταγονίδια νερού με παγιδευμένα πολλά ακανόνιστα σταγονίδια ελαίου. Τα σύνθετα γαλακτώματα σταθεροποιημένα με Span 20 είχαν ακανόνιστο σχήμα σταγονιδίων και αυξημένη ετερογένεια όσον αφορά το μέγεθος των σταγονιδίων νερού με πολλά μεγάλα συσσωρευμένα σταγονίδια ελαίου. Αντίστοιχα τα δείγματα που είχαν σταθεροποιηθεί με το Tween 40, παρουσίασαν ένα πιο ομοιογενές δίκτυο σφαιρικών σταγονιδίων νερού. Τέλος, παρατηρήθηκε ότι αυξάνοντας το κλάσμα όγκου της διεσπαρμένης φάσης, ανεξάρτητα από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου γαλακτωματοποιητή, η παρουσία συστάδων ήταν συχνότερη και τα σταγονίδια ήταν μεγάλα. Τα πολλαπλά νανογαλακτώματα ε/ν/ε με βάση το πυρηνέλαιο είχαν ομογενή κατανομή λεπτών σφαιρικών σταγονιδίων. Αντιθέτως, τα πολλαπλά νανογαλακτώματα με βάση το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο ήταν ετερογενή με ακανόνιστο σχήμα και με πολλά μεγάλα συσσωματώματα σταγονιδίων. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι η ενσωμάτωση CLA ή CoQ10 δεν είχε σημαντική επίδραση στη δομή των δειγμάτων. Τέλος, η ενσωμάτωση πολυφαινολών στηn ενδιάμεση υδατική φάση του σύνθετου γαλακτώματος ε/ν/ε οδήγησε σε πιο σφαιρικά και ομοιογενή εσωτερικά σταγονίδια. Από τη μελέτη επομένως διαφαίνεται ότι το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο και το πυρηνέλαιο αποτελούν κατάλληλη επιλογή λιπαρής φάσης για τον σχηματισμό διπλών νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε και νανογαλακτωμάτων ε/ν. Επιπλέον, τίθεται η βάση για περαιτέρω μελέτη και αξιοποίηση των υπερήχων για τον σχηματισμό νανογαλακτωμάτων τροφίμων. Η ομογενοποίηση με υπέρηχους για το δεύτερο στάδιο της διεργασίας αποτελεί μία εξελισσόμενη μέθοδο η οποία παρουσιάζει πλεονεκτήματα όπως η ευκολία χειρισμού, ο μικρός χρόνος διεργασίας και η απαίτηση μικρών συγκεντρώσεων γαλακτωματοποιητών μικρού μορίου. Τέλος, η ταυτόχρονη ενσωμάτωση ευαίσθητων λιπόφιλων βιοδραστικών συστατικών (συζυγές λινελαϊκό οξύ, συνένζυμο Q10) και υδρόφιλων πολυφαινολών ανοίγουν το δρόμο, έτσι ώστε να μελετηθεί η ενσωμάτωση άλλων βιοδραστικών συστατικών, αρωματικών συστατικών ακόμη και αντιμικροβιακών παραγόντων και να αναπτυχθεί η χρήση των διπλών νανογαλακτωμάτων ε/ν/ε ως συστήματα χορήγησης. Ωστόσο, κρίνεται απαραίτητη η περαιτέρω έρευνα και μελέτη της δομής, των ιδιοτήτων, της χημικής και φυσικής σταθερότητας των σύνθετων αυτών κολλοειδών δομών. Επιπλέον, χρήσιμη θα ήταν η περαιτέρω μελέτη γύρω από τις συνθήκες ομογενοποίησης με υπερήχους.