Καινοτόμος μέθοδος για παραγωγή οίνου σε οικιακή κλίμακα με ξηρές πρώτες ύλες

Abstract

The biotechnological processes concerning wine making were reviewed in the first section of this thesis. Even though there are many research proposals for industrial wine making, the available literature for home wine making is scarce. Therefore the present thesis has focused on the development of a novel method for home winemaking, using mixtures of dried raw materials and freeze dried biocatalysts of free and immobilized cells. In order to characterize the proposed method as novel in alcoholic fermentation technology, short fermentation times and good ethanol yields should be obtained, while the final product’s quality and consistency were evaluated. Delignified cellulosic materials and gluten pellets were used as immobilization supports. These materials are of food grade purity, cheap and abundant in nature. Freeze drying of cells was performed with a cooling rate of 3°C/min without use of any protecting medium. Use of Scanning Electron Microscopy confirmed that cells continue to be attached to the supports after freeze drying. Additionally, a lyophilization method of grape must was developed and the best results were obtained when delignified cellulosic materials were used as protecting media. Firstly, batch fermentations of glucose and invert sugar synthetic media were carried out. These media were obtained after the addition of distilled water to mixtures of dried sugars and freeze dried biocatalysts. The proposed methodology was found suitable for alcohol production in the range of 4-12.9% v/v at temperatures 1-30°C. Freeze dried immobilized cells gave shorter start-up times of fermentation, lower fermentation times, higher ethanol concentrations, higher ethanol productivities, lower residual sugar values and higher conversion rates, compared to free freeze dried cells. Additionally, freeze dried immobilized cells retained their fermentation activity regardless of the mixture’s prolonged storage at 4°C, in contrast to free freeze dried cells. Low temperature fermentations with freeze dried immobilized cells resulted in final products with improved quality, since ethyl acetate concentrations were increased and higher alcohol concentrations were reduced with decreasing temperature. Among the tested immobilization supports, delignified cellulosic materials gave better results regarding the kinetic parameters and volatile by-products formation compared to gluten pellets. Furthermore, experiments were conducted at various temperatures for raisin wine making, using mixtures of dried raisin berries and freeze dried biocatalysts. Fermentations were completed at reasonable times in every case, while total and volatile acidities in the wines produced were similar to those of commercial products. At all temperatures, freeze dried immobilized cells promoted alcoholic fermentation rate, leading to low values of residual sugar. When fermentations were carried out in a home refrigerator with freeze dried immobilized cells, the final products were of improved quality, had high degree of clarity and low volatile acidity. Also, they contained high percentages of ethyl acetate and low percentages of amyl alcohols on total volatiles determined. Free freeze dried cells’ viability and consequently their fermentative activity decreased with increasing storage time of mixtures, while the glucolytic activity of freeze dried immobilized cells was maintained at high levels. Finally, long term preservation of mixtures that contained freeze dried biocatalysts and raw materials did not have negative effects on product’s consistency and quality, since no visible contamination of final products was detected and volatiles composition was not altered. The last section of the thesis involved experiments concerning wine making in a home refrigerator. Batch fermentations of mixtures of freeze dried grape must and biocatalysts were carried out. This novel wine making method provided wines with usual and low alcohol content, since in all cases reasonable fermentation times, alcohol concentrations similar to those of dry wines and low values of residual sugar were recorded. Moreover, total and volatile acidities were similar to those of commercial products. For all fermentation batches, freeze dried immobilized cells led to higher wine and ethanol productivities and to higher conversion rates compared to free freeze dried cells. Fermentations at temperatures <10°C produced wines of improved quality, which contained high concentrations of ethyl acetate and low concentrations of amyl alcohols and acetaldehyde. Increased storage times of mixtures did not affect negatively the fermentative capacity of freeze dried immobilized cells and the quality of the final products, as well. Freeze dried immobilized cells on delignified cellulosic materials resulted to lower fermentation times at low temperatures, higher ethyl acetate and lower amyl alcohols concentrations compared to freeze dried gluten supported biocatalyst. The improved quality of products obtained at low temperatures using freeze dried immobilized cells was also confirmed by GC-MS analysis. Most of the compounds identified were esters, alcohols and organic acids. At all studied temperatures, more esters were determined in wines produced with freeze dried immobilized cells, while the amount of esters was increased and the amount of alcohols was decreased with temperature drop. The final estimation of wines’ quality was performed in the frame of preliminary sensory evaluation and the panelists showed preference to those wines produced using freeze dried immobilized cells on delignified cellulosic materials. To conclude, the novel home winemaking method proposed in the present thesis, seems to be suitable for the production of ethanol, raisin wine and dry wines with usual and low alcohol content. All fermentations were carried out using freeze dried, free and immobilized cells. Wine production in a household refrigerator with freeze dried immobilized cells led to acceptable productivities and to final products of improved quality. This fact was confirmed using instrumental analytical methods and preliminary sensory evaluation, as well. In every case improved results were obtained when fermentations were conducted by freeze dried immobilized cells on delignified cellulosic materials.

Στο πρώτο μέρος της διατριβής έγινε ανασκόπηση της βιβλιογραφίας που αφορά τις βιοτεχνολογικές διεργασίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται τα τελευταία 30 χρόνια στην παραγωγή οίνου. Παρόλο που για τη βιομηχανική παραγωγή οίνου έχουν γίνει αρκετές προτάσεις και έρευνες, οι ερευνητικές προσπάθειες που έγιναν για την οικιακή οινοποίηση είναι ελάχιστες. Έτσι, η παρούσα διατριβή επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη μιας καινοτόμου μεθόδου για οινοποίηση σε οικιακή κλίμακα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η δυνατότητα παραγωγής διαφόρων τύπων οίνου σε οικιακό ψυγείο με τη χρήση μιγμάτων ξηρών πρώτων υλών και λυοφιλιωμένων καθαρών στελεχών ζυμών με ελεύθερα και ακινητοποιημένα κύτταρα. Για να χαρακτηρισθεί η μέθοδος αυτή ως καινοτόμος, εξετάσθηκε αν ικανοποιούνται τα κριτήρια των κινητικών παραμέτρων της αλκοολικής ζύμωσης, ενώ τα τελικά προϊόντα που προέκυψαν αξιολογήθηκαν ως προς τη σταθερότητα και την ποιότητά τους. Ως φορείς ακινητοποίησης των κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά και σφαιρίδια γλουτένης, υποστρώματα που είναι φθηνά, άφθονα στη φύση και κατάλληλα για τρόφιμα. Η λυοφιλίωση των κυττάρων, ελεύθερων και ακινητοποιημένων, έγινε με ρυθμό ψύξης 3°C/min χωρίς τη χρήση προστατευτικών μέσων. Με τη χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου επιβεβαιώθηκε ότι τα κύτταρα εξακολουθούν να είναι προσκολλημένα σε όλους τους φορείς μετά τη λυοφιλίωσή τους. Επίσης, αναπτύχθηκε μέθοδος λυοφιλίωσης του γλεύκους κατά την οποία τα καλύτερα αποτελέσματα ελήφθησαν όταν χρησιμοποιήθηκαν τα απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά ως προστατευτικά μέσα. Αρχικά, έγιναν ζυμώσεις διαλυμάτων γλυκόζης και ιμβερτοσακχάρου που προέκυψαν μετά την προσθήκη νερού σε μίγματα ξηρών σακχάρων και λυοφιλιωμένων βιοκαταλυτών. Η μέθοδος βρέθηκε κατάλληλη για την παραγωγή αιθανόλης σε εύρος συγκεντρώσεων 4-12.9% ν/ν, ενώ οι ζυμώσεις έγιναν σε περιοχή θερμοκρασιών 1-30°C. Τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα έδωσαν μικρότερους χρόνους έναρξης της ζύμωσης, μικρότερους χρόνους ζύμωσης, μεγαλύτερες συγκεντρώσεις αιθανόλης, μεγαλύτερες τιμές ρυθμού παραγωγής αιθανόλης, χαμηλότερες τιμές αζύμωτου σακχάρου και μεγαλύτερα ποσοστά μετατροπής, σε σχέση με τα ελεύθερα λυοφιλιωμένα κύτταρα. Επίσης, διατήρησαν τη ζυμωτική τους ικανότητα ανεξάρτητα από το χρόνο αποθήκευσης των μιγμάτων στους 4°C, κάτι που δε συνέβη για τα ελεύθερα λυοφιλιωμένα κύτταρα. Τέλος, τα προϊόντα που προέκυψαν από ζυμώσεις με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα σε χαμηλές θερμοκρασίες είχαν καλύτερη ποιότητα, καθώς περιείχαν υψηλότερες συγκεντρώσεις οξικού αιθυλεστέρα και χαμηλότερες συγκεντρώσεις ανωτέρων αλκοολών. Αναφορικά με τις κινητικές παραμέτρους και τα πτητικά παραπροϊόντα των ζυμώσεων, τα απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά έδωσαν καλύτερα αποτελέσματα σε σχέση με τη γλουτένη. Στη συνέχεια μελετήθηκε η παραγωγή σταφιδίτη οίνου σε διάφορες θερμοκρασίες με τη χρήση μιγμάτων ξηρής σταφίδας και λυοφιλιωμένων βιοκαταλυτών ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων. Σε όλες τις περιπτώσεις οι ζυμώσεις έγιναν σε αποδεκτούς χρόνους, ενώ η ολική και πτητική οξύτητα των οίνων βρέθηκαν στα επίπεδα που συναντιόνται στα εμπορικά προϊόντα. Σε κάθε θερμοκρασία ζύμωσης, τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα προήγαγαν το ρυθμό της ζύμωσης και οδήγησαν σε χαμηλές τιμές αζύμωτου σακχάρου. Όταν οι ζυμώσεις έγιναν σε οικιακό ψυγείο με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα, προέκυψαν προϊόντα βελτιωμένης ποιότητας, που ήταν διαυγή και είχαν χαμηλή πτητική οξύτητα, ενώ περιείχαν υψηλά ποσοστά οξικού αιθυλεστέρα και χαμηλά ποσοστά ανώτερων αλκοολών στο σύνολο των πτητικών. Η αύξηση του χρόνου αποθήκευσης των μιγμάτων δεν επηρέασε τη γλυκολυτική δράση των λυοφιλιωμένων ακινητοποιημένων κυττάρων, κάτι που δεν συνέβη στον ίδιο βαθμό για τα ελεύθερα λυοφιλιωμένα κύτταρα. Τέλος, η ποιότητα των τελικών προϊόντων δεν επηρεάσθηκε αρνητικά από την αύξηση του χρόνου αποθήκευσης των μιγμάτων, καθώς μακροσκοπικά δεν παρατηρήθηκε μόλυνση του ζυμούμενου υγρού και τα κύρια πτητικά παραπροϊόντα παρέμειναν σταθερά. Στο τελευταίο μέρος της διατριβής εξετάσθηκε η πιθανότητα οινοποίησης σε οικιακό ψυγείο. Προς τούτο έγιναν ζυμώσεις γλεύκους που προήλθε από μίγματα λυοφιλιωμένου γλεύκους και λυοφιλιωμένων βιοκαταλυτών. Η καινοτόμος μέθοδος οινοποίησης χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για την παραγωγή οίνων με συνήθη και χαμηλή περιεκτικότητα σε αλκοόλη, αφού σε όλες τις περιπτώσεις καταγράφηκαν αποδεκτοί χρόνοι ζύμωσης, συγκεντρώσεις αιθανόλης παρόμοιες με αυτές των ξηρών οίνων και χαμηλό αζύμωτο σάκχαρο. Επίσης, η ολική και η πτητική οξύτητα ήταν στα επιτρεπτά όρια των ξηρών οίνων. Για όλες τις ζυμώσεις, τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα έδωσαν μεγαλύτερες παραγωγικότητες οίνου και αιθανόλης, καθώς και μεγαλύτερα ποσοστά μετατροπής σε σχέση με τα ελεύθερα λυοφιλιωμένα. Η χρήση των λυοφιλιωμένων ακινητοποιημένων βιοκαταλυτών σε θερμοκρασίες μικρότερες των 10°C έδωσε οίνους με βελτιωμένη ποιότητα, που περιείχαν υψηλές συγκεντρώσεις οξικού αιθυλεστέρα και χαμηλές συγκεντρώσεις αμυλικών αλκοολών και ακεταλδεΰδης. Η αύξηση του χρόνου αποθήκευσης των μιγμάτων δεν επηρέασε αρνητικά την ζυμωτική ικανότητα των λυοφιλιωμένων ακινητοποιημένων κυττάρων και την ποιότητα των τελικών προϊόντων. Τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα σε απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά οδήγησαν σε μικρότερους χρόνους ζύμωσης σε χαμηλές θερμοκρασίες, καθώς και σε υψηλότερες συγκεντρώσεις οξικού αιθυλεστέρα και χαμηλότερες συγκεντρώσεις αμυλικών αλκοολών, σε σχέση με το λυοφιλιωμένο βιοκαταλύτη της γλουτένης. Η ανάλυση με αέρια χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας επιβεβαίωσε την καλύτερη ποιότητα των οίνων που προήλθαν από τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα σε χαμηλές θερμοκρασίες. Οι περισσότερες από τις ενώσεις που ταυτοποιήθηκαν ήταν εστέρες, αλκοόλες και οξέα. Για τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα ανιχνεύθηκαν περισσότεροι εστέρες σε όλες τις θερμοκρασίες, ενώ με τη μείωση της θερμοκρασίας το ολικό ποσό των εστέρων αυξήθηκε και των ανωτέρων αλκοολών μειώθηκε. Η τελική αξιολόγηση της ποιότητας έγινε με προκαταρκτικό οργανοληπτικό έλεγχο, κατά τον οποίο οι δοκιμαστές έδειξαν προτίμηση στους οίνους από λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα σε απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά. Συμπερασματικά, η καινοτόμος μέθοδος οινοποίησης που προτείνεται στην παρούσα διατριβή φαίνεται να είναι κατάλληλη για την παραγωγή σταφιδίτη οίνου, καθώς και ξηρών οίνων με συνήθη και χαμηλή περιεκτικότητα σε αλκοόλη σε οικιακή κλίμακα. Οι ζυμώσεις έγιναν με τη χρήση λυοφιλιωμένων ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων. Η οινοποίηση σε οικιακό ψυγείο με τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα οδήγησε σε αποδεκτές τιμές παραγωγικότητας, καθώς και σε προϊόντα βελτιωμένης ποιότητας και οργανοληπτικού χαρακτήρα. Το γεγονός αυτό πιστοποιήθηκε τόσο με ενόργανες μεθόδους ανάλυσης, όσο και με προκαταρκτική οργανοληπτική δοκιμασία. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα καλύτερα αποτελέσματα ελήφθησαν όταν χρησιμοποιήθηκαν λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα σε απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά.