Study of state-dependent allosteric cholesterol binding sites in adenosine A2A, A1 receptors using coarse-grained molecular dynamics simulations in plasma mimetic membranes

Abstract

For this thesis, coarse-grained molecular dynamics (CG MD) simulations were implemented in order to study protein-cholesterol interactions for different activation states of the A2A adenosine receptor (A2AR) and A1 adenosine receptor (A1R) and predict new cholesterol binding sites including amino acid residues with high residence time in three biologically relevant membranes namely; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) : cholesterol, POPC : cholesterol: phosphatidylinositolbisphosphate (PIP2) and a plasma mimetic membrane. Compared to POPC-cholesterol and POPC-PIP2-cholesterol, the plasma mimetic membrane was found to best describe the cholesterol binding sites previously detected for the inactive state of A2AR and revealed the binding sites with long-lasting amino acid residues. When using the plasma mimetic membrane and plotting residues with cholesterol residence time ≥ 2 μs, CG MD simulations captured most obviously the cholesterol – protein interactions. As mentioned, binding sites for A1R and A2AR in which cholesterol is bound to residues with long residence time were also calculated and for the inactive state of A2AR one more binding site compared to the previously detected was identified. For the active state of A2AR, three new binding sites were identified. For the active state of A1R three new binding sites were found and finally for the inactive state A1R two new binding sites were identified.For the active states, cholesterol was found to bind to residues with much longer residence time compared to the inactive state for both A2AR and A1R. The stability of the identified binding sites to A1R or A2AR with CG MD simulations were additionally investigated using potential of mean force calculations using umbrella sampling. The binding sites which were found to have residues to which cholesterol have long residence time in the active or inactive states of A2AR were found to have shallow binding free energy minima compared to the related binding sites in A1R, suggesting a stronger binding for cholesterol to A1R (i.e., generally higher association rates), however this remains to be experimentally demonstrated. The differences in binding sites, in which cholesterol is stabilized and interacts with residues with long residence time, between active and inactive states of A1R and for A2AR can be important for functional activity and orthosteric agonist or antagonist affinity and can be used for the design of allosteric modulators which can bind through lipid pathways.

Για αυτή τη διατριβή, χρησιμοποιήθηκαν προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής αδροποιήμενων προτύπων (Coarse Grained MD) προκειμένου να μελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-χοληστερόλης για τις διαφορετικές καταστάσεις ενεργότητας του υποδοχέα αδενοσίνης A2A (A2AR) και του υποδοχέα αδενοσίνης A1 (A1R) και να προβλεφθούν νέες θέσεις δέσμευσης χοληστερόλης συμπεριλαμβανομένων των αμινοξέων με υψηλό χρόνο παραμονής της χοληστερόλης σε τρεις βιολογικά σχετικές μεμβράνες και συγκεκριμένα τις: 1-παλμιτοϋλ-2-ελαιοϋλ-sn-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (POPC): χοληστερόλη, POPC: χοληστερόλη: διφωσφορική φωσφατιδυλινοσιτολη (ΡΙΡ2) και σε μεμβράνη που προσομοιάζει την κυτταρική πλασματική μεμβράνη.Σε σύγκριση με την POPC-χοληστερόλη και την POPC-PIP2-χοληστερόλη, η μεμβράνη που προσομοιάζει την κυτταρική πλασματική μεμβράνη βρέθηκε ότι περιγράφει καλύτερα τις θέσεις δέσμευσης χοληστερόλης που είχαν ανιχνευθεί σε άλλες μελέτες για την ανενεργή κατάσταση του A2AR και αποκάλυψε τις θέσεις δέσμευσης με αμινοξέα με μεγάλους χρόνους παραμονής της χοληστερόλης. Κατά τη χρήση της μεμβράνης που προσομοιάζει την κυτταρική πλασματική μεμβράνη και τη γραφική παράσταση αμινοξέων με χρόνο παραμονής χοληστερόλης ≥ 2 μs, οι προσομοιώσεις αδροποιημένων προτύπων κατέγραψαν προφανέστερα τις αλληλεπιδράσεις χοληστερόλης-πρωτεΐνης. Υπολογίστηκαν επίσης οι θέσεις δέσμευσης για τους υποδοχείς A1R και A2AR στις οποίες η χοληστερόλη είναι συνδεδεμένη με αμινοξέα για μεγάλο χρόνο παραμονής. Για τον υποδοχέα A2AR στην ανενεργό κατάσταση εντοπίστηκε μία ακόμη θέση δέσμευσης σε σύγκριση με τις ήδη διερευνημένες θέσεις. Για την ενεργή κατάσταση του υποδοχέα A2AR, ταυτοποιήθηκαν τρεις νέες θέσεις δέσμευσης, για την ενεργή κατάσταση του A1R τρεις νέες θέσεις δέσμευσης και τέλος για την ανενεργή κατάσταση του A1R δύο νέες θέσεις δέσμευσης.Όταν οι υποδοχείς βρίσκονται στις ενεργές καταστάσεις, η χοληστερόλη βρέθηκε να συνδέεται με αμινοξέα για πολύ μεγαλύτερο χρόνο παραμονής σε σύγκριση με την ανενεργή κατάσταση τόσο για τον υποδοχέα A2AR όσο και για τον A1R. Η σταθερότητα των προσδιορισμένων θέσεων δέσμευσης στους υποδοχείς αυτούς που υπολογίστηκαν με τις προσομοιώσεις αδροποιημένων προτύπων διερευνήθηκαν επιπρόσθετα χρησιμοποιώντας υπολογισμούς δυναμικού μέσης δύναμης χρησιμοποιώντας δειγματοληψία ομπρέλας. Οι θέσεις δέσμευσης αυτές, που βρέθηκαν να έχουν αμινοξέα στα οποία η χοληστερόλη έχει μεγάλο χρόνο παραμονής είτε στην ενεργή ή στην ανενεργή κατάσταση του υποδοχέα A2AR βρέθηκε να έχουν ρηχά ελάχιστα ελεύθερης ενέργειας σύνδεσης σε σύγκριση με τις σχετικές θέσεις δέσμευσης στον υποδοχέα A1R, υποδηλώνοντας έτσι, ισχυρότερη σύνδεση της χοληστερόλης στον υποδοχέα A1R. (δηλαδή, γενικά υψηλότερα ποσοστά συσχέτισης), ωστόσο αυτό μένει να αποδειχθεί πειραματικά.Οι διαφορές στις θέσεις δέσμευσης, στις οποίες η χοληστερόλη σταθεροποιείται και αλληλοεπιδρά με αμινοξέα με μεγάλο χρόνο παραμονής, μεταξύ ενεργής και ανενεργής κατάστασης του A1R και του A2AR μπορεί να είναι σημαντικές για τη λειτουργεία και τη σύνδεση του ορθοστερικού αγωνιστή ή ανταγωνιστή και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό αλλοστερικών ρυθμιστών που μπορούν να συνδέονται μέσω λιπιδικών μονοπατιών.