Αξιοποίηση της κινναμωμικής ομάδας στον σχεδιασμό, σύνθεση και φαρμακοχημική μελέτη νέων παραγώγων με δράση σε πολλαπλούς βιολογικούς στόχους

Abstract

Cinnamic acids are a group of chemical compounds with a wide variety of biological effects, including: anti-inflammatory activity correlated to the inhibition of various enzymes involved in inflammation, antioxidant activity through scavenging of free radicals, antibacterial, anticancer and analgesic activities. Furthermore, cinnamic acids derivatives are components of various plants, while at the same time being precursors of coumarin derivatives. Due to all these reasons, these compounds are of particular synthetic and biological interest both as final and as intermediate products. The treatment of complex diseases, where more than one biological target is implicated (enzymes or protein receptors), stimulates the interest of investigators, as a single drug is not always able to adequately control the disease and a therapeutic approach through combination of drugs with different therapeutic profiles is frequently used. Such multifactorial phenomena are associated with the development of inflammation, blood coagulation and cancer, where various enzymes are involved, such as cycloxygenase (COX), lipoxygenase (LOX), proteolytic enzymes but also carbonic anhydrase and hCA IX. For the treatment of multi-factorial diseases hybrid drugs have been used, that combine two or more pharmacophore groups on the same scaffold with the goal to create a chemical entity more medically effective than its individual components. In this context, recently there has been an increasing interest in the combination of two pharmacophores for the design and synthesis of multifunctional hybrid molecules.Based on previous research efforts where appropriately substituted cinnamic acids presented significant inhibition of soybean lipoxygenase, this PhD thesis focused on the design and synthesis of even more active LOX inhibitors, through docking simulation binding studies (virtual screening using the model of S-LOX-1), along with 2D-QSAR studies, based on literature data of cinnamic derivatives acting on multiple targets. In this context, new pleiotropic agents were designed, combining substituted cinnamic acids with known drug molecules (e.g. paracetamol, propranolol, atenolol, 4-methylumbelliferone, 1-adamantylamine, 1-adamantanol, benzocaine, sulfonamides) or "drug-like" molecules [e.g., 4-, 7-, coumarins, m-acetamidophenol, p- / m- aminophenol, 2-(benzylamino)ethan-1-ol]. These new hybrid derivatives are divided into two classes: a) esters of cinnamic acid and b) amides of cinnamic acid. The selection of the coumarin scaffold as a structural group for the design and synthesis of multifunctional compounds was based on the fact that the coumarin derivatives present similar biological profile to the cinnamic derivatives. The development of coumarins as antioxidant agents, anticancer and LOX inhibitors has attracted much attention recently. Taking into consideration, the fact that the coumarin ring is an internal ester of o-hydroxy cinnamic acid, indicating the chemical affinity between cinnamic and coumarin derivatives, coumarin derivatives have been included in our study. Moreover, recent studies have demonstrated that 6- and 7- or 6,7-disubstituted coumarin derivatives exhibit effective inhibitory activity against cancer-related carbonic anhydrase isoforms IX and XII. Thus, we proceeded to the development of non-sulphonamide carbonic anhydrase inhibitors of 6/7 coumarinyl-oxy acetic acid derivatives with “drug-likeness” groups. In our design we combine the coumarin ring with the acetic acid group (non-steroidal anti-inflammatory derivatives of acetic acid are known in the literature), which is coupled to “drug-likeness” hetero-, aromatic or aleiphatic amines (phenethylamine, benzylamine, aniline, methyl-aminobenzoate, pyridine, morpholine and piperidine groups etc.), with the aim to design possible pleiotropic agents.The synthesis of cinnamic acid is based on the known condensation reaction between the appropriately substituted aldehyde and malonic acid in the presence of bases. Regarding the synthesis of 6,/7- coumarinyloxy acetic acid, known modified synthetic procedure was followed, where commercially available 6- or 7- coumarins reacted with ethyl iodoacetate, leading to coumarinyloxy- acetic acid ester, which were then hydrolysed in alkaline conditions to the corresponding coumarinyl-acetic acids. These compounds were obtained in good yields, and the physicochemical and spectroscopic data are identical to those reported in the relevant literature.The synthesis of novel hybrid compounds was based on the implementation of known and modified procedures and simple techniques, in an attempt to have efficient yields. The structures of the compounds are identified by IR, 1H-NMR, 13C-NMR, LC/MS, ESI and elemental analysis. Lipophilicity is a physicοchemical property playing a crucial role in the absorption, distribution, and excretion of drug-molecules. Lipophilicity values of compounds were calculated theoretically as ClogP (C-QSAR, Bioloom Biobyte programs) and experimentally by reversed chromatography method as RM values.The physicochemical and pharmacokinetic properties of the newly synthesized compounds were calculated by the implementation of C-QSAR and Molinspiration program. All compounds show molecular weight less than 500, with the exception of the hybrid of phenoxycinnamic acid with m-aminophenol (compound 26), which appears to violate two Lipinski rules. Most of the molecules can be easily transported and diffused, while ten compounds violate the Lipiski rule in terms of lipophilicity.Hybrid compounds were studied by in vitro experiments for their behavour to act as potential lipoxygenase inhibitors, as potential inhibitors of trypsin and as potential inhibitors of the carbonic anhydrase I, II, IV, IX. Their antioxidant activities were determined as well. In particular, the compounds were tested in the following experiments: Pharmacochemical tests in vitro: 1. Inhibition of lipid peroxidation using AAPH [2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide]. 2. Soybean lipoxygenase inhibition assay. 3. Inhibition of proteolytic action of trypsin 4.Inhibition of different isoforms of carbonic anhydrase I, II, IV, IX. Biological experiment in vivo: Behavioral tests were carried out for the evaluation of peripheral nerve damage and possible recovery after administration of the hybrid derivative 3 (naphthyl-substituted cinnamate with paracetamol), which presented the most promising in vitro profile among the paracetamol hybrids. From the obtained results, we find that most of the compounds exhibited a significant ability to inhibit lipid peroxidation of linoleic acid induced by AAPH. Moreover, most of the hybrid compounds exhibit greater anti-lipid peroxidation activity than the precursor cinnamic acids.Biological results confirm that most compounds (2, 5, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 15, 22, 23, 24, 27, 28-33) showed pleiotropic activity inhibiting both soybean lipoxygenase and trypsin. In particular, the naphthyl-substituted cinnamic acid hybrid with paracetamol (compound 3) is a dual inhibitor of LOX and trypsin enzymes.The hybrid of phenoxycinnamic acid with 3-acetamidophenol (compound 10) showed significant potent inhibitory activity against LOX (IC50 = 0.34 μM) followed by the amide of the same acid with propranolol (compound 32) presenting IC50 = 6 μM, compared to the reference NDGA compound. The compound 32 combines potent activity also against two biological targets: lipoxygenase and trypsin. The 3,4-dimethoxycinnamic ester of hymechromone (compound 15) highly inhibits trypsin (IC50 = 0.1 μM) followed by the hybrids of atenolol, which appeared to be more active than those of propranolol. Among the tested hybrids of paracetamol most potent were found to be compounds 3, 5 and 8. Significant activity demonstrated by the bromobenzyloxycinnamic acid derivative with hymechromone (compound 14: IC50 = 5 μM). 6/7-coumarinyloxy-acetic acid derivatives did not significantly inhibit the widespread cytosolic isoforms hCA I and II, being weak hCA IV inhibitors, thus making them selective inhibitors of hCA IX. In particular, compound 39 (6-substituted coumarinynyloxyacetamide bearing the benzylamine group) presented significant inhibition of carbonic anhydrase IX, compared to the reference compound, acetazolamide. Compounds 36, 37 are dual inhibitors of LOX and carbonic anhydrase IX. The results from the in vivo study show that the derivative of paracetamol 3 improves the functional repair of the sciatic nerve in rats, compared to paracetamol, and appears to be a promising agent for the treatment of peripheral nerve injuries in combination with its other actions.

Τα παράγωγα των κινναμωμικών οξέων αποτελούν μια ομάδα χημικών ενώσεων με τεράστια ποικιλία βιολογικών δράσεων. Μεταξύ των δράσεων αυτών συγκαταλέγονται η αντιφλεγμονώδης, η οποία εκδηλώνεται μέσω της αναστολής διαφόρων ενζύμων που εμπλέκονται στο φαινόμενο της φλεγμονής, η αντιοξειδωτική, μέσω της παγίδευσης ελευθέρων ριζών, η αντιμικροβιακή, η αντικαρκινική και η αναλγητική. Επιπλέον, τα παράγωγα του κινναμωμικού οξέος απαντώνται σε διάφορα φυτά και αποτελούν πρόδρομες ενώσεις κουμαρινικών παραγώγων. Για τους παραπάνω λόγους, οι ενώσεις αυτές παρουσιάζουν ιδιαίτερο συνθετικό και βιολογικό ενδιαφέρον τόσο ως τελικά, αλλά και ως ενδιάμεσα προϊόντα.Η θεραπεία πολυπαραγοντικών ασθενειών, στην οποία εμπλέκονται περισσότεροι από ένα βιολογικοί στόχοι (ένζυμα ή πρωτεϊνική υποδοχείς), κεντρίζει το ενδιαφέρον ερευνητών, καθώς ένα μόνο φάρμακο συχνά καθίσταται ανεπαρκές και απαιτείται θεραπευτική προσέγγιση μέσω συνδυασμού φαρμάκων με διαφορετικά θεραπευτικά προφίλ. Σε τέτοιου είδους πολυπαραγοντικά φαινόμενα, όπως η ανάπτυξη φλεγμονής, η πήξη του αίματος και η ανάπτυξη καρκίνου, εμπλέκονται διάφορα ένζυμα όπως η κυκλοξυγονάση (COX), η λιποξυγονάση (LOX), πρωτεολυτικά ένζυμα αλλά και η καρβονική ανυδράση η hCA IX που αποτελούν μοριακούς στόχους για την ανάπτυξη πολυδύναμων μορίων. Για την αντιμετώπιση πολυπαραγοντικών καταστάσεων έχει προταθεί η χρήση υβριδικών φαρμάκων, τα οποία συνδυάζουν δύο ή περισσότερες φαρμακοφόρες ομάδες σε ένα ενιαίο μόριο, σηματοδοτώντας την εκδήλωση έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος αναφορικά με τον σχεδιασμό και τη σύνθεση πολυλειτουργικών υβριδικών μορίων. Έχοντας ως βάση πρότερες ερευνητικές προσπάθειες όπου κατάλληλα υποκατεστημένα κινναμωμικά οξέα εμφάνισαν ικανοποιητική αναστολή της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής και με στόχο τον σχεδιασμό δραστικότερων αναστολέων LOX, πραγματοποιήθηκαν μελέτες πρόσδεσης (virtual screening), χρησιμοποιώντας μοντέλα λιποξυγονάσης S-LOX-1, και 2D-QSAR αναλύσεις, όπου επιλέχθηκαν υβριδικά παράγωγα του κινναμωμικού οξέος με δράση σε πολλαπλούς στόχους. Για τον σχεδιασμό και τη σύνθεση νέων πλειοτροπικών ενώσεων, συνδυάστηκαν παραγώγα του κινναμωμικού οξέος με γνωστά φαρμακομόρια (π.χ. παρακεταμόλη, προπρανολόλη, ατενολόλη, υμεχρωμόνη, 1-αδαμαντιλαμίνη, 1-αδαμαντανόλη, βενζοκαϊνη, σουλφοναμίδια) ή «φαρμακομιμητικά» μόρια (π.χ. 4-, 7-, κουμαρίνες, μ-ακετάμιδοφαινόλη, π-/ μ-αμινοφαινόλη, βενζυλαμινο-αιθανόλη). Τα νέα υβριδικά παράγωγα διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: α) εστέρες του κινναμωμικού οξέος και β) αμίδια του κινναμωμικού οξέος. Η επιλογή επίσης του κουμαρινικού συστήματος ως δομικού σκελετού των ενώσεων που σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν, βασίστηκε στο γεγονός ότι τα κουμαρινικά παράγωγα εμφανίζουν ανάλογες προς τα κινναμωμικά παράγωγα δράσεις, μεταξύ των οποίων αναφέρονται η αντιφλεγμονώδης, η αντιοξειδωτική και η αντικαρκινική. Παράλληλα, το γεγονός ότι ο κουμαρινικός δακτύλιος αποτελεί εσωτερικό εστέρα του ο-υδροξυ κινναμωμικού οξέος, σηματοδοτώντας τη χημική συγγένεια μεταξύ των κινναμωμικών και κουμαρινικών παραγώγων, συμπεριελήφθησαν και κουμαρινικά παράγωγα στη μελέτη. Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν ότι τα 6- και 7- ή 6,7-δισυποκατεστημένα κουμαρινικά παράγωγα εμφανίζουν αποτελεσματική ανασταλτική δράση έναντι των σχετιζόμενων με καρκίνο ισομορφών καρβονικής ανυδράσης IX και XII. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκαν μη σουλφοναμιδικοί αναστολείς καρβονικής ανυδράσης, 6/7-κουμαρινυλοξυ-ακεταμίδια, συνδυάζοντας παράγωγα 6/7 υδροξυ υποκατεστημένης κουμαρίνης με την ομάδα του οξικού οξέος (μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη παράγωγα του οξικού οξέος είναι γνωστά στη βιβλιογραφία), η οποία συζευγνύεται με ομάδες που εμφανίζουν φαρμακο-ομοιότητα (φαιναιθυλαμίνη, βενζυλαμίνη, ανιλίνη, ο-αμινοβενζοϊκός μεθυλεστέρας, ομάδες πυριδίνης, μορφολίνης και πιπεριδίνης κ.α.), στοχεύοντας σε πιθανή εμφάνιση πλειοτρόπου δράσης.Για τη σύνθεση των πρόδρομων κινναμωμικών οξέων έλαβε χώρο η αντίδραση Knoevenagel-Doebner μεταξύ της κατάλληλα υποκατεστημένης αλδεΰδης και του μηλονικού οξέος παρουσία βάσεων. Η σύνθεση των 6,/7- κουμαρινυλοξυ-οξικών οξέων πραγματοποιήθηκε βάση γνωστής κατάλληλα τροποποιημένης αντίδρασης αιθεροποίησης μεταξύ της εμπορικά διαθέσιμης 6- ή 7- κουμαρίνης και του ιωδοοξικό αιθυλεστέρα και ακολούθως υδρόλυση προς παρασκευή κουμαρινυλοξυ-οξικών οξέων. Οι ενώσεις λήφθηκαν με ιδιαίτερα ικανοποιητικές αποδόσεις, ενώ τα φασματοσκοπικά και φυσικοχημικά δεδομένα ταυτίζονται με τα αναφερόμενα στη σχετική βιβλιογραφία. Για τη σύνθεση των νέων υβριδικών ενώσεων του κινναμωμικού οξέος, εφαρμόστηκαν γνωστές αλλά και τροποποιημένες αντιδράσεις και τεχνικές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία, με βασικό στόχο την εξεύρεση μεθόδων απλών στην εφαρμογή και αποτελεσματικών ως προς την αποδόση. Η σύνθεση των κουμαρινυλ-οξυ ακεταμιδίων βασίστηκε στην αντίδραση σύζευξης μεταξύ των 6/7- κουμαρινυλοξυ-οξικών οξέων και των αρωματικών ή αλειφατικών αμινών. Για την ταυτοποίηση των δομών, χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι ενόργανης ανάλυσης, φασματοσκοπία IR, 1H-NMR, 13C-NMR, MS(ΕSI), στοιχειακή ανάλυση και χρωματογραφικές μέθοδοι. Η λιποφιλικότητα είναι μια φυσικοχημική ιδιότητα που καθορίζει την απορρόφηση, κατανομή, δράση και απέκκριση των μορίων. Οι τιμές λιποφιλικότητας των ενώσεων υπολογίστηκαν θεωρητικά ως τιμές ClogP (C-QSAR, Bioloom Biobyte) και πειραματικά ως τιμές RM με τη μέθοδο χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης.Υπολογίστηκαν οι φυσικοχημικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες των νεοσυντιθέμενων ενώσεων με τη βοήθεια του προγράμματος C-QSAR και με την εκτέλεση του ελεύθερης πρόσβασης προγράμματος Molinspiration. Όλες οι ενώσεις εμφανίζουν μοριακό βάρος μικρότερο από 500, με εξαίρεση το μικτό υβρίδιο του φαινοξυκινναμωμικού οξέος με την μ-αμινοφαινόλη (ένωση 26), το οποίο παραβιάζει δύο κανόνες του Lipinski. Τα περισσότερα μόρια αποδεικνύεται ότι είναι δυνατόν να μεταφερθούν και να διαχυθούν διαμέσου βιολογικών μεμβρανών. Δέκα ενώσεις παραβιάζουν τον κανόνα του Lipiski ως προς την λιποφιλικότητα.Οι υβριδικές ενώσεις μελετήθηκαν με τη βοήθεια πειραμάτων in vitro και in vivo για τη δράση τους ως πιθανοί αναστολείς λιποξυγονάσης, ως προς την αντιοξειδωτική τους ικανότητα, ως πιθανοί αναστολείς του ενζύμου της θρυψίνης και ως πιθανοί αναστολείς των ισομορφών της καρβονικής ανυδράσης Ι, ΙΙ, ΙV, IX. Ειδικότερα, οι ενώσεις δοκιμάστηκαν στα παρακάτω πειράματα: Βιολογικές δοκιμασίες in vitro: 1. Αναστολή της υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από το ΑΑΡΗ. 2. Αναστολή του ενζύμου της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης (από σόγια). 3. Αναστολή της πρωτεολυτικής δράσης της θρυψίνης4.Αναστολή της δράσης διαφορετικών ισομορφών της καρβονικής ανυδράσης I, II, IV, IX. Βιολογικά πειράματα in vivo: Εκτέλεση αισθητικοκινητικών δοκιμασιών για την αξιολόγηση και πιθανή αποκατάσταση βλάβης ισχιακού περιφερικού νεύρου έπειτα από χορήγηση εφάπαξ δόσης του υβριδικού παραγώγου ναφθυλο-υποκατεστημένου κινναμωμικού οξέος με την παρακεταμόλη.Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν διαπιστώθηκε ότι οι περισσότερες ενώσεις παρουσίασαν ικανοποιητική ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από το AAPH.Τα βιολογικά αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η πλειοψηφία των ενώσεων (2, 5, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 15, 22, 23, 24, 27, 28-33) αποτελούν πλειοτρόπα υβριδικά παράγωγα με εκδήλωση δράσης έναντι της λιποξυγονάσης και της θρυψίνης. Ειδικότερα η ένωση του ναφθυλο-υποκατεστημένου κινναμωμικού οξέος με την παρακεταμόλη (ένωση 3) αποτελεί δραστικό αναστολέα των ενζύμων LOX και θρυψίνης.Την ισχυρότερη δράση έναντι της S-LOX έδειξε η εστερική ένωση του φαινοξυ-κινναμωμικού οξέος με την 3-ακεταμιδοφαινόλη (ένωση 10) με ΙC50= 0.34 μM, ακολουθούμενη από την αμιδική ένωση 32 (φαινοκινναμωμικό οξύ με την προπρανολόλη) με ΙC50= 6 μM, συγκριτικά με την ένωση αναφοράς NDGA. Παράλληλα, η ένωση 32 συνδυάζει ισχυρή δράση σε δύο μοριακούς στόχους, την λιποξυγονάση και την θρυψίνη.Η ένωση με την ισχυρότερη δράση έναντι της θρυψίνης είναι ο εστέρας του διμεθοξυκινναμωμικού οξέος με την υμεχρωμόνη (ένωση 15: ΙC50 = 0.1 μM) ακολουθούμενη από τα υβρίδια της ατενολόλης που αποδείχθηκαν δραστικότερα των αντίστοιχων της προπρανολόλης. Μεταξύ των υβριδίων της παρακεταμόλης αξιοσημείωτη δράση εμφάνισαν τα παράγωγα 3, 5 και 8. Σημαντική δράση απέδειξε το παράγωγο του βρωμοβενζυλοξυκινναμωμικού οξέος με την υμεχρωμόνη (ένωση 14: ΙC50= 5 μM).Τα 6/7- παράγωγα του κουμαρινυλοξυ-οξικού οξέος εκλεκτικά αναστέλλουν την καρβονική ανυδράση ΙΧ, με ισχυρότερη την ένωση 39, που αποτελεί 6-υποκατεστημένο κουμαρινινυλοξυ-ακεταμίδιο που φέρει την ομάδα της βενζυλαμίνης.Οι ενώσεις 36, 37 συνδυάζουν ισχυρή δράση σε δύο μοριακούς στόχους στην καρβονική ανυδράση ΙΧ και στη λιποξυγονάση.Τέλος, τα αποτελέσματά από την in vivo μελέτη αποδεικνύουν ότι το υβριδικό παράγωγο της παρακεταμόλης (ένωση 3) βελτιώνει την λειτουργική αποκατάσταση του ισχιακού νεύρου σε επίμυες και φαίνεται να αποτελεί έναν υποσχόμενο παράγοντα για την θεραπεία τραυματισμών του περιφερικού νεύρου σε συνδυασμό με τις άλλες του δράσεις.