Μέθοδοι μεταβολομικής ανάλυσης για την εύρεση βιοδεικτών άσκησης και γήρανσης σε θηλαστικά

Abstract

Aging is an inevitable descending process of the whole organism. Training and especially mild life-long exercise has been found to reduce the severity of aging. Aging and exercise are therefore two factors that strongly affect the whole metabolome. In this dissertation, samples from exercise and sedentary rats were studied for the first time, in a period of 21 months. Metabolomics-based analysis using GC-MS and LC-MS/MS of rat fecal and cecal samples in order to investigate the alterations according to exercise and along with aging, is also a novel aspect of this study. Serving the aims of this dissertation, 60 female rats were separated randomly in four groups: one sedentary (group A) and 3 exercise groups with different exercise time periods. The exercise groups were submitted to a training protocol when they reached adulthood. The exercise groups were consisted of animals (group B) that were exercised for the whole period of their life (15-16 months), animals (group C) that were exercised for 10 months and then rested for the next period of their life and animals (group D) that were exercised for 6 months in the last period of their life. The training protocol was consisted of 15–18 min of swimming, 2–5 days per week, with a load of weight (4– 0 % of their body weight) attached to rats’ tails depending on their age. Urine, blood and fecal samples were collected in strictly scheduled time points and tissues were collected post mortem. Optimization of fecal sample preparation for both untargeted NMR and GC-MS and for targeted HILIC-MS / MS analysis was also performed for the first time. The critical parameters that were optimized, were the extraction ratio, the nature and pH value of the extraction solvent. The ratio 1/2 (Wf/Vs) provided richer results under neutral conditions, for both non-targeted and targeted approaches. Extraction with acetonitrile showed greater metabolite coverage, by LC-MS/MS analysis. Fecal samples of sedentary and exercise rats were analyzed by NMR spectroscopy and by targeted HILIC-MS / MS method. Exercise affected amino acids related pathways as long as other hallmarks of energy fuels, along with the intensity and duration in the rat fecal metabolic profiles. Aging also affected fecal metabolome in almost the same manner. Changes in the gut microbiota were reflected also on rat cecal metabolic profiles, in which amino acids and lipids alterations were found. Exercise resulted in the differentiation of sedentary versus exercise rats in every examined time point of urine collection. Perturbed lipids', amino acids', carbohydrates' metabolism summarized the findings of the effect of exercise and aging on rat urine metabolic profiles. Whole blood samples were also analyzed in order to extract information on the effect of exercise along with aging. Changes in the metabolism of amino acids, in Kreb's cycle metabolites and in purines' and pyrimidines' biochemical pathways concluded the alterations on rat whole blood samples.

H γήρανση είναι μία αναπόφευκτη διαδικασία φθίνουσας εξέλιξης, όλου του οργανισμού. Η μη εξαντλητική, αερόβια, μακροχρόνια άσκηση, έχει βρεθεί ότι πιθανόν μειώνει το φαινότυπο της γήρανσης. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναλύθηκαν για πρώτη φορά, διαφορετικά βιολογικά δειγμάτα επιμύων που ασκούνταν ή ήταν καθιστικά, με 3 αναλυτικές τεχνικές, για διάστημα 21 μηνών. Η χρήση δειγμάτων κοπράνων για την εξέταση της επίδρασης της άσκησης στο μεταβόλομα επιμύων παράλληλα με τη γήρανση έγινε για πρώτη φορά. Επιπλεόν, στα πλαίσια της μελέτης, αναλύθηκαν δείγματα ιστού εντέρου, με σκοπό να συμπληρώσουν το πάζλ της επίδρασης της άσκησης στο μεταβολικό αποτύπωμα των επιμύων. Για την υλοποίηση της μελέτης, 60 θηλυκοί επίμυες της φυλής Wistar χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες, ανάλογα με τη διάρκεια της άσκησης. Την πρώτη ομάδα αποτελούσαν οι επίμυες που δεν πραγματοποίησαν καθόλου άσκηση σε όλη τη διάρκεια της ζωής τους, τη δεύτερη ομάδα οι επίμυες που ασκήθηκαν δια βίου (δηλαδή από τον 5 μήνα της ζωής τους μέχρι τον 21), την τρίτη ομάδα οι επίμυες που ασκήθηκαν από τον 5 μέχρι τον 15 μήνα και τέλος, την τέταρτη ομάδα οι επίμυες που ασκήθηκαν από τον 15 μήνα μέχρι τον 21. Η άσκηση που εκτέλεσαν οι επίμυες ήταν κολύμβηση με ανάρτηση βάρους στην ουρά, από 4- 0 % του σωματικού τους βάρους (μειούμενο με την ηλικία). Η άσκηση των επιμύων πραγματοποιούνταν 2-5 φορές την εβδομάδα, για 15-18 λεπτά την ημέρα, ανάλογα με την ηλικία. Δείγματα ούρων, αίματος και κοπράνων συλλέγονταν σε προγραμματισμένα, τακτά χρονικά διαστήματα και ιστοί συλλέχθηκαν μετά την ευθανασία των πειραματόζωων. Στα πλαίσια της διατριβής, πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά μελέτη προκατεργασίας δειγμάτων κοπράνων επιμύων, τόσο για μη στοχευμένη ανάλυση με φασματοσκοπία NMR και GC–MS, όσο και για στοχευμένη ανάλυση με HILIC-MS/MS. Οι κρίσιμες παράμετροι που βελτιστοποιήθηκαν, ήταν o λόγος εκχύλισης, η φύση και η τιμή pΗ του διαλύτη εκχύλισης. Ως βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης των δειγμάτων κοπράνων κρίθηκαν ο λόγος 1/2 υπό ουδέτερες συνθήκες, για τη μη στοχευμένη και στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση, με διαλύτη εκχύλισης το ακετονιτρίλιο. Ακόμη αναλύθηκαν δείγματα κοπράνων των ασκούμενων και των καθιστικών επιμύων της μελέτης από διάφορα χρονικά σημεία δειγματοληψίας με φασματοσκοπία NMR και με τη στοχευμένη μέθοδο HILIC-MS/MS. Υπό την επίδραση της άσκησης και της γήρανσης, στο μεταβολικό αποτύπωμα των κοπράνων, παρατηρήθηκαν αλλαγές στο μεταβολισμό των αμινοξέων και στα σχετιζόμενα με τα ενεργειακά «καύσιμα» μονοπάτια. Κυρίως αμινοξέα και λιπαρά οξέα βρέθηκαν να ευθύνονται για το διαχωρισμό των δειγμάτων των ασκούμενων από τα δείγματα των καθιστικών επιμύων με βάση τα μεταβολικά προφίλ που λήφθηκαν από την ανάλυση των δειγμάτων εντέρου. Σε όλα τα εξεταζόμενα σημεία δειγματοληψίας δειγμάτων ούρων, η επίδραση της άσκησης έγινε εμφανής και μάλιστα ήταν ανάλογη του χρόνου άσκησης. Το ολικό αίμα αποδείχθηκε κατάλληλο υπόστρωμα για τη μελέτη της επίδρασης της άσκησης. Οι αλλαγές στο μεταβολισμό των αμινοξέων, στους μεταβολίτες του κύκλου του Krebs και στα παράγωγα των πουρινών και των πυριμιδινών, δείχνουν ότι και οι δύο εξεταζόμενοι παράγοντες επηρέασαν σημαντικά αλλά και παρόμοια βιοχημικά μονοπάτια.