Ταυτόχρονος φθορισμομετρικός προσδιορισμός βιογενών αμινών σε δείγματα τροφίμων με τις τεχνικές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης και των διαδοχικών εγχύσεων.

Abstract

Biogenic amines (BΑs), at low concentrations levels, are essential for a variety of physiological functions in human. On the contrary, at high concentration levels BAs could exhibit toxic effects, which are determined by the susceptibility of the individual and the possible presence of factors that act synergistically. The clinical symptoms appear immediately and are usually mild, but even fatalities have been reported. For this reason, it is necessary to develop sensitive, selective and reliable methods for controlling the levels of biogenic amines in food of high risk, such as seafood and cheeses, but also in food widely consumed, such as milk. In this thesis, chromatographic methods for the simultaneous determination biogenic amines mixtures in foodstuffs, after derivatization with naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA), were developed and optimized. For this reason, the conditions of chromatographic separation, derivatization reaction and fluorescence detection were studied and optimized. Derivatization was performed before the chromatographic separation either conventionally or automatically by coupling the chromatographic system to a sequential injection analyzer. Furthermore, the optimal pretreatment conditions for samples of fresh and canned tuna, feta, cheese, semi-skimmed cow's milk and cocoa milk, and full-fat cow's milk were studied. This thesis presents the detection of cyano-benzo-isoindole derivatives of biogenic amines in food, as well as the derivatization under flow conditions with this reagent for the first time in the literature. The selected reagent proved to be both selective and sensitive, offering at least one order of magnitude higher sensitivity for all amines over other methods using derivatization with OPA and Dns-Cl (except putrescine and cadaverine). The incorporation of SIA into the chromatographic configuration, allows the fully-automated derivatization, minimizing reaction time and handling errors. All the described methods make use of simple elution programs, resulting in baseline separation of all analytes. The methods include a simple, time- and cost- effective pretreatment of the samples, which are injected without any further purification being necessary. The good linearity, the satisfactory recovery results for all amines, the high levels of sensitivity and precision and the exceptional robustness recommend the use of the proposed methods whenever the need for results of high analytical quality is warranted.

Οι βιογενείς αμίνες, σε χαμηλές συγκεντρώσεις, είναι απαραίτητες για πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του ανθρώπινου οργανισμού. Αντίθετα, σε υψηλές συγκεντρώσεις μπορεί να εμφανίσουν τοξική δράση, που καθορίζεται από την επιδεκτικότητα του κάθε ατόμου και την πιθανή παρουσία παραγόντων, που δρουν συνεργιστικά. Τα κλινικά συμπτώματα εμφανίζονται άμεσα και συνήθως είναι ήπια, ωστόσο έχουν αναφερθεί ακόμη και θανατηφόρα περιστατικά. Για το λόγο αυτό, κρίνεται απαραίτητη η ανάπτυξη ευαίσθητων, εκλεκτικών και αξιόπιστων μεθόδων ελέγχου των επιπέδων των βιογενών αμινών στα λεγόμενα τρόφιμα υψηλής επικινδυνότητας, όπως τα ιχθυηρά και τα τυριά, αλλά και σε τρόφιμα ευρείας κατανάλωσης, όπως το γάλα. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν χρωματογραφικές μέθοδοι για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μίγματος βιογενών αμινών σε τρόφιμα ζωικής προέλευσης, μετά από παραγωγοποίησή τους με ναφθαλινο-2,3-δικαρβοξαλδεΰδη. Κατά την ανάπτυξη των μεθόδων, μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες του χρωματογραφικού διαχωρισμού, της αντίδρασης παραγωγοποίησης και της φθορισμομετρικής ανίχνευσης. Η παραγωγοποίηση πραγματοποιήθηκε πριν το χρωματογραφικό διαχωρισμό είτε με συμβατικό τρόπο είτε αυτοματοποιημένα με σύζευξη του χρωματογραφικού συστήματος με αναλυτή διαδοχικής έγχυσης δείγματος σε ροή. Επίσης, βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες προκατεργασίας για δείγματα φρέσκου και κονσερβοποιημένου τόνου, τυριού φέτας, κασεριού, ημιαποβουτυρωμένου αγελαδινού και σοκολατούχου γάλακτος, καθώς και πλήρους αγελαδινού γάλακτος. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται για πρώτη φορά η ανίχνευση των κυανο-βενζο-ισοϊνδολο-παραγώγων των βιογενών αμινών σε τρόφιμα, καθώς και η παραγωγοποίηση σε συνθήκες ροής με το συγκεκριμένο αντιδραστήριο. Η παραγωγοποίηση με το συγκεκριμένο αντιδραστήριο αποδείχτηκε ιδιαίτερα εκλεκτική και ευαίσθητη, προσφέροντας τουλάχιστον μία τάξη μεγέθους υψηλότερη ευαισθησία για όλες τις αμίνες συγκριτικά με άλλες μεθόδους που χρησιμοποιούν παραγωγοποίηση με ΟΡΑ και Dns-Cl (εκτός από την πουτρεσκίνη και την καδαβερίνη). Η ενσωμάτωση του αναλυτή SIA στο χρωματογραφικό σύστημα, επιτρέπει την πλήρως αυτοματοποιημένη παραγωγοποίηση, ελαχιστοποιώντας το χρόνο αντίδρασης και τα σφάλματα χειρισμού. Όλες οι αναπτυχθείσες μέθοδοι κάνουν χρήση απλών προγραμμάτων έκλουσης, που οδηγούν στον πλήρη διαχωρισμό όλων των αναλυτών. Οι μέθοδοι περιλαμβάνουν μία απλή, αποτελεσματική, σύντομη και χαμηλού κόστους προκατεργασία των δειγμάτων, τα οποία εγχύονται στο χρωματογραφικό σύστημα χωρίς να απαιτείται περαιτέρω καθαρισμός τους. Η καλή γραμμικότητα, οι ικανοποιητικές ανακτήσεις, η υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια, και η εξαιρετική ευρωστία των μεθόδων αυτών συνιστούν τη χρήση τους για αναλύσεις υψηλής ποιότητας.