Η έκφραση της Focal Adhesion Kinase, Src kinase και Paxillin σε κυτταρολογικό υλικό ασθενών με νευρoβλάστωμα

Abstract

Background: Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial tumor in children, arising from the neural crest of the sympathetic ganglia and accounts for 7-10% of all pediatric cancers. To date, the most important prognostic marker for NB is the N-Myc gene. We already know from adult malignancies that proteins such as Focal Adhesion Kinase, Src kinase and Paxillin are overexpressed in adult malignancies and their degree of expression correlates with tumor grading and patients’ survival. We have previously proposed that those proteins interact with each other comprising the FAK-Src-Paxillin system. Objective: The current study tests the hypothesis that the expression of the FAK-Src-Paxillin system is increased in a. human NB cell lines and b. in biopsy specimens of patients with advanced stage of NB and is associated with poor clinical outcome.Design/Methods: Initially, the cells of the following cell lines were cultured in culture media: Κ562, ΝΙΗ/3T3, CCF-STTG1, SKNSH, IMR-32 and U-87-MG. Subsequently, using western blot, the expression of FAK, Src kinase and Paxillin was analyzed semi-quantitatively based on the intensity of the staining using specific antibodies for these proteins. (Stark 1979). Using immunohistochemistry with monoclonal antibody SC 1688 anti FAK, SC 5266 anti SRC and SC anti Paxillin, we determined the expression of FAK, Src kinase and Paxillin in tissue specimens of 23 children with advanced (Stage IV) NB. The biopsy material was obtained with Fine Needle Aspiration (FNA). The tissue was maintained in the form of cell blocks (Orell and Sterrett's Fine Needle Aspiration Cytology, Philadelphia 2005). The expression of FAK-Src-Paxillin for each patient was correlated with the clinical outcome and with the presence of N-Myc amplification.Results: In human NB cell lines, the expression of FAK, Src kinase and Paxillin was increased compared to the expression of b-actin. The expression of FAK, Src kinase and Paxillin staining was present in 59%, 32% and 33% respectively in biopsy specimens of children with neuroblastoma. Simultaneous FAK, Src kinase and Paxillin staining was present in 30% of all the patients studied. Out of the patients that did not survive, 70% showed expression of FAK-Src-Paxillin proteins. Only 14% of the patients who died were found to stain negative for all three proteins although they expressed positive for N-myc amplification. The isolated increased expression of Paxillin was associated to poorer survival and disease persistence. When the FAK and Src kinase proteins were taken individually there was no statistically significant association between its expression and the survival of the children. However, when we analyzed the impact of simultaneous expression of the proteins to the survival we found an additive effect. Children who were positive for all three proteins and the N-Myc gene have had poor outcome when compared to children who were negative for the proteins and the N-Myc gene. Conclusions: The data provide evidence that FAK-Src-Paxillin system is expressed by advanced-stage NB and provide a rationale for inhibition of these proteins. We propose that the concurrent inhibition of the FAK-Src-Paxillin system, with new-generation selective small molecules, may yield better results in patients with NB.

Γενικά: Το νευροβλαστωμα αποτελεί εμβρυϊκής προέλευσης όγκο προερχόμενο από κύτταρα νευρικής ακρολοφίας (συμπαθητικά γάγγλια, μυελώδης μοίρα των επινεφριδίων). Είναι ο πιο συχνός εξωκρανιακός όγκος στα παιδιά και αποτελεί το 7-10% των παιδικών κακοηθειών. Γνωρίζουμε πως, σε ασθενείς σταδίου IV, η πενταετής επιβίωση είναι συνήθως μικρότερη του 40%. Έως τώρα γνωρίζουμε πως η έκφραση του γονιδίου N-Myc αποτελεί σημαντικό αρνητικό προγνωστικό παράγοντα σε ασθενείς με νευροβλάστωμα. Γνωρίζουμε επίσης από προηγούμενες μελέτες πως ορισμένα κακοήθη νεοπλάσματα ενηλίκων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών Focal Adhesion Kinase, Src και Paxillin και πως η έκφρασή τους συσχετίζεται με τη σταδιοποίηση των όγκων και την επιβίωση των ασθενών. Οι πρωτεϊνες FAK-Src-Paxillin βρίσκονται στην υπομεμβρανική περιοχή των Focal Adhesions (FΑs). H δομή των FAs αλλάζει συνεχώς καθώς το σήμα μεταδίδεται από τον πυρήνα στην πλασματική μεμβράνη μέσω του κυτταροπλάσματοςΈτσι ξεκινάει η κυτταρική κινητικότητα και η μετάστασηΣκοπός: Θελήσαμε να να διερευνήσουμε αν το σύμπλοκο FAK-Src-Paxillin, εκτός από τα κακοήθη νεοπλάσματα ενηλίκων, εκφράζεται και στο νευροβλάστωμα. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο προσδιορισμός της έκφρασης της FAK-Src-Paxillin α.Σε κυτταρικές σειρές ανθρωπίνου νευροβλαστώματος και β.σε κλινικό υλικό παιδιών με νευροβλάστωμα διερευνώντας πιθανή συσχέτιση της έκφρασής τoυς με την κλινική έκβαση των παιδιών.Υπόθεση: Η έκφραση του συμπλόκου FAK-Src-PΑΧ είναι αυξημένη σε κυτταρικές σειρές και κλινικό υλικό ασθενών με νευροβλάστωμα και συσχετίζεται με την πρόγνωσή τους.Υλικό και Μέθοδοι: Αρχικά, για τη μελέτη των κυτταρικών σειρών, τα κύτταρα των σειρών Κ562, ΝΙΗ/3T3, CCF-STTG1, SKNSH, IMR-32 και U-87-MG καλλιεργήθηκαν σε τριβλία κυτταροκαλλιέργειας. Έγινε ανάλυση της έκφρασης Src, FAK και Paxillin σε 10% SDS-PAGE Western-blot, immunoblot με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων. (Stark 1979). Εξετάστηκε η έκφραση της καθε πρωτεϊνης με βάση την ένταση χρώσης ημιποσοτικά. Στη συνέχεια, για τη μελέτη του κλινικού υλικού, εξετάστηκαν 23 παιδιά με σταδίου IV νευροβλάστωμα από το Institut Curie, Παρίσι. Έγινε ανάλυση στις Κλινικές Πληροφορίες των ασθενών και εξετάστηκε με ανοσοϊστοχημεία κλινικό υλικό το οποίο προήλθε μετά από βιοψία με λεπτή βελόνη (FNA), μονιμοποίηση και διατήρηση του υλικού με μορφή cell block (Orell and Sterrett's Fine Needle Aspiration Cytology, Philadelphia 2005). Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση στα αποτελέσματα της έκφρασης των ενζύμων στις κυτταρικές σειρές καθώς και στα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημείας στα cell blocks από τις βιοψίες των ασθενών με Χ2. Η συσχέτιση της έκφρασης των ενζύμων με την επιβίωση των ασθενών πραγματοποιήθηκε με τις καμπύλες Kaplan Meier. Αποτελέσματα: Στις κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών FAK, Src και Paxillin σε σύγκριση με την έκφραση της πρωτεϊνης μάρτυρα b-actin. Σε ότι αφορά το κλινικό δείγμα, η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 3 ± 1.3 έτη (SD 0.2 με 5.5 έτη) . Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε 8 άρρενα και 15 θήλεα άτομα. Όλοι οι ασθενείς ήταν σταδίου IV. Το γονίδιο N-myc ήταν υπερεκφρασμένο σε 9 ασθενείς. Η παρακολούθησή τους έγινε από 12 έως και 120 μήνες μετά τη διάγνωση (μέσος όρος 50 μήνες). Η έκφραση της FAK ήταν αυξημένη σε 14/23 ασθενείς (59%). Η Src kinase εμφάνισε αυξημένη έκφραση σε 8/23 ασθενείς (32%) και η Paxillin εμφάνισε αυξημένη έκφραση σε 9/23 ασθενείς (33%). Με βάση τα παρόντα στοιχεία, η μεμονωμένη έκφραση της FAK και της Src kinase φαίνεται πως δε συσχετίζεται σημαντικά με την επιβίωση των ασθενών. Η έκφραση της Paxillin, αντίθετα, δείχνει να συσχετίζεται σημαντικά με την κλινική έκβαση των ασθενών όταν το τελικό γεγονός ήταν η μη επιβίωση ή η επιβίωση με παρουσία νόσου είτε υποτροπής. Ταυτόχρονη έκφραση FAK-Src-Paxillin συσχετίζεται με πιο δυσμενή πρόγνωση παιδιών με νευροβλάστωμα σε σύγκριση με παιδιά που δεν εμφάνισαν έκφραση και των τριων πρωτεϊνών. Η ταυτόχρονη έκφραση του συμπλόκου FAK-Src-Paxillin σε συνδυασμό με την υπερέκφραση του γονιδίου N-Myc συσχετίστηκε με ακόμη πιο δυσμενή πρόγνωση. Συμπέρασμα: Η έκφραση του συμπλόκου FAK-Src-PΑΧ είναι αυξημένη σε κυτταρικές σειρές ανθρωπίνου νευροβλαστώματος. Η έκφραση του συμπλόκου FAK-Src-Paxillin είναι αυξημένη σε κλινικό υλικό ασθενών με νευροβλάστωμα και ίσως συνδέεται με δυσμενή έκβαση της κλινικής τους πορείας. Θεωρούμε πως το επόμενο βήμα είναι ίσως η στόχευση του συμπλόκου FAK-Src-Paxillin με ειδικούς αναστολείς μικρού μοριακού βάρους κάτι που ίσως οδηγήσει σε καλύτερη πρόγνωση των παιδιών με νευροβλάστωμα