In vitro μελέτη της επίδρασης του TNFa στον κυτταροσκελετό σπειραματικών επιθηλιακών κυττάρων (ποδοκυττάρων)

Abstract

Glomerular permeability for macromolecules depends partially on proper attachment of the glomerular epithelial cells (GEC) to the glomerular basement membrane (GBM). The latter requires integrity of the actin cytoskeleton, which in turn is regulated by specific actin – associated proteins. Since several glomerulopathies characterized by heavy proteinouria are associated with increased glomerular tumor necrosis factor α (TNF-α) expression, we studied the interaction of TNF-α with the actin cytoskeleton of cultured rat GEC. Incubation of GEC with 10 ng/ml TNF-α for variable time periods runding from 15 min to 24 hr demonstrated a marked accentuation and redistribution of actin microfilaments, as shown by direct fluorescence analysis and confocal laser scanning microscopy. Quantitative biochemical determination of the G/total – actin ratio confirmed the above observations. Indeed, this ratio was significantly reduced, indicating substantial polymerization of G-actin and formation of F-actin. Concurrently, TNF-α rapidly induced tyrosine phosphorylation of both paxillin and focal adhesion kinase, without affecting the expression levels of these two proteins. In addition, tyrosine phosphorylation of vinculin became evident, indicating involvement of this focal adhesion marker in the observed actin reorganization. Inhibition of tyrosine phosphorylation by genistein prevented the reorganization of the actin cytoskeleton by TNF-α. We conclude that TNF-α induces substantial reorganizatoin of actin cytoskeleton and focal adhesion. These effects occur simultaneously, with a promet TNF-α – induced tyrosine phosphorylation of paxillin and focal adhesion kinase, indicating that these proteins, shown to regulate actin polymerization and formation of focal adhesions, may be directly involved in the mechanism controlling the observed actin redistribution. We studied effects of TNFα upon the proliferation, cell volume and apoptosis glomerular epithelial cells. Incubation of GEC evidence with TNF-α (10 ng/ml) for 15 min, 2h, 4h and 24h increased of cell volume, while there is no evidence proliferation and apoptosis. These findings suggest that the observed TNF-α-actin cytoskeleton interactions may relate to the pathogenesis of glomerulopathies with heavy proteinuria, in which increased glomerular expression of TNF-α is associated with disturbances in the attachment of podocytes to the GBM.

Η ακεραιότητα του φραγµού διήθησης των σπειραµατικών τριχοειδών, ο οποίος παρεµποδίζει τη διήθηση µακροµορίων, εξαρτάται, σε σηµαντικό βαθµό, από την αρτιότητα της πρόσφυσης των σπειραµατικών επιθηλιακών κυττάρων (ποδοκυττάρων) στη βασική σπειραµατική µεµβράνη. Εξάλλου, η πρόσφυση των ποδοκυττάρων εξαρτάται από την ακεραιότητα του κυτταροσκελετού της ακτίνης, η οποία µε τη σειρά της ρυθµίζεται από ειδικές συνδεόµενες µε την ακτίνη πρωτεΐνες. ∆εδοµένου ότι ορισµένες σπειραµατοπάθειες που χαρακτηρίζονται από βαριά λευκωµατινουρία, συνοδεύονται από αυξηµένη έκφραση του σπειραµατικού TNFα, µελετήσαµε την επίδραση του TNFα στον κυτταροσκελετό της ακτίνης, σε καλλιέργειες κυτταρικής σειράς ποδοκυττάρων αρουραίου. Όπως διαπιστώθηκε µε άµεσο ανοσοφθορισµό και µικροσκοπία συνεστίασης, η επώαση των ποδοκυττάρων µε 10 ng/ml TNFα, για χρονικά διαστήµατα από 5 λεπτά έως 24 ώρες, προκάλεσε εκσηµασµένη αύξηση της πυκνότητας και ανακατανοµή των µικροϊνιδίων της ακτίνης. Η παραπάνω παρατήρηση επιβεβαιώθηκε µε ποσοτικό βιοχηµικό προσδιορισµό του κλάσµατος G/ολικής ακτίνης και της de novo σύνθεσης ακτίνης. Πράγµατι, διαπιστώθηκε µια σηµαντική, ταχείας έναρξης και παρατεταµένη µείωση του λόγου G/ολικής ακτίνης, ενδεικτική πολυµερισµού της G- προς F-ακτίνη, αλλά και de novo σύνθεση ακτίνης. Παράλληλα µε τον πολυµερισµό της ακτίνης, ο TNFα προκάλεσε µια ταχέως επαγόµενη τυροσινική φωσφορυλίωση της παξιλλίνης και της κινάσης των εστιακών προσφύσεων (FAK), χωρίς να µεταβάλλει τα επίπεδα έκφρασης των δύο αυτών πρωτεϊνών. Επίσης, η διαπιστωθείσα τυροσινική φωσφορυλίωση της βινκουλίνης απετέλεσε ένδειξη ότι, η πρωτεΐνη αυτή των εστιακών προσφύσεων, συµµετέχει στην παρατηρούµενη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Επιπλέον, η αναστολή της τυροσινικής φωσφορυλίωσης µε γενιστεϊνη αναστέλει την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης από τον TNFα. Τέλος, πέραν των προαναφερόμενων µεταβολών, η έκθεση των ποδοκυττάρων σε TNFα οδηγεί σε αύξηση του κυτταρικού τους όγκου, χωρίς όµως να επηρεάζει τον κυτταροπολλαπλασιασµό ή την κυτταρική απόπτωση. Συμπεραίνουμε ότι, στο κυτταρικό µας σύστηµα, ο TNFα επάγει µια σηµαντική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και των εστιακών προσφύσεων. Τα δύο αυτά φαινόµενα, τα οποία συµπίπτουν χρονικά, συνοδεύονται από µια άµεση, TNFα-επαγώµενη, τυροσινική φωσφορυλίωση της FAK και της παξιλλίνης. ∆εδοµένου ότι, όπως είναι γνωστό, οι δύο αυτές πρωτεΐνες ρυθµίζουν τον πολυµερισµό της ακτίνης και τη συγκρότηση των εστιακών προσφύσεων, θεωρούµε πολύ πιθανό ότι εµπλέκονται ευθέως στην παρατηρούµενη αναδιάταξη της ακτίνης. Στο σύνολό τους, τα ευρήµατα της παρούσας µελέτης επιτρέπουν το συµπέρασµα ότι οι επαγώµενες από τον TNFα διαταραχές, οι οποίες διαπιστώθηκαν στο κυτταρικό µας σύστηµα, ενδέχεται να αποτελούν το µοριακό υπόβαθρο των διαταραχών της πρόσφυσης των ποδοκυττάρων στη βασική σπειραµατική µεµβράνη, οι οποίες χαρακτηρίζουν τις σπειραµατοπάθειες µε βαριά λευκωµατινουρία. Η υπερέκφραση του σπειραµατικού TNFα, η οποία έχει διαπιστωθεί στις σπειραµατοπάθειες αυτές θα µπορούσε να είναι µέρος του µηχανισµού, που προκαλεί ή/και συντηρεί τη σπειραµατική βλάβη.