Μεταγραφική και επιγενετική ρύθμιση σε μοντέλα καρκίνου του μαστού: ο ρόλος της πρωτεΐνης της προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (PML)

Abstract

Breast cancer, the most common cancer in women, is a heterogeneous disease. Ηeterogeneity sources are the cell of origin, driver mutations combination, clonal and epigenetic evolution, which is reflected in the diversity of its phenotypes, therapy response and clinical outcomes. Those factors affect cell proliferation rates , the frequency and site of metastases and therapy resistance. The heterogeneity, which results from genetic and epigenetic changes, may also develop over time within the same subtype or even the same tumor itself, thus making targeted-personalized approaches a high priority to achieve effective theparies. To this end understanding the molecular mechanisms that govern the tumor biological and clinical behavior is of outmost importance. Promyelocytic leukemia protein (PML) is the core organizer of nuclear structures that facilitate diverse protein-protein inteactions and posttranslational modifications of key regulatory factors that mediate multiple effects in cell survival. PML has first recognized as a fusion with the RARa receptor that causes Acute Myelocytic Leukemia. Following studies assign to PML a tumor suppressor properties mediated by pro-apoptotic, pro-aging and cell cycle inhibitory signals in line with lack of expression in samples of primary tumors, including breast cancer. However, more recent studies, revealed that in a context dependent way, PML may also show pro-oncogenic properties. Specifically, in chronic myeloid leukemia (CML), in glioblastomas (GBM) and in some cases of triple-negative breast cancer (TNBC), PML is higly expressed, helping to maintain the cancer population, either by regulating their cell cycle, or by contributing to the regulation of cancer stem cells self-renewal. Consequently, PML has a dual role in tumourigenesis acting as a tumour suppressor or promoter in cell specific contexts. The aim of this dissertation was to clarify the molecular targets through which PML regulates the stemness and metastasis of breast cancer cells as a first step that towards understanding the role of molecular players that determine its pro- or anti-oncogenic action, using a PML knock down in well characterized human cancer cell models. Our experimental results suggest that PML loss enhances cell mobility and the mesenchymal features in cell culture and the aggressive behavior of MDA-MB--231 cell type manifested high graft-site tumor growth, lymph node and lung metastasis rate but not the epithelial ER positive MCF7 cells. Histology results indirectly point to higher vascularization of PML-KD tumors an affect that may be mediated by a higher hypoxic response. More importantly, cell lines derived from in vivo primary tumors or lung metastasis have further enhanced aggressive and proangiogenic properties that may result from epigenetic or extensive clonal selection in vivo in the absence of PML. PML interacts with p53 target factors, such as EMT factors and HIF1a, regulating their action according to the genetic background of the cells.Interestingly, we found that various the bHLH type factors that include the HIF1a master hypoxia regulator and EMT mediators such as Twist and Snail interact with PML and are likely inhibited from exerting their EMT via DNA binding. Thus PML impedes the aggresive EMT-metastatic behavior of MDA- MB-231 but not MCF7 cells that do not express EMT factors or properties. In agreement with the above, transcriptional profiling of these cells reveals that important biological functions such as cell adhesion, cell cycle, and signaling pathways associated with cell metastasis are deregulated by PML knock down in MDA–MB-231 but not MCF7 cells. A common link in the above results may the p53 tumor suppressor protein. Wild type p53 is activated and bound by PML under stress to mediate pro-senescence and apoptotic functions. We show here that PML binds much stronger to mutant forms of p53 as found in the MDA-MB-231 (R280K) relative to wild type p53 carried by MCF7 cells. Since mutant p53 is a strong gain of fuction oncogenic driver, we assume that PML is a functional barrier to the tumor–promoting action of mutant p53 as indicated by TCGA survival data that correlate high PML expession with better prognosis in mutant p53 but not wild type p53 TNBC patients. PML loss may thus release activity of mutant p53 to promote metastasis via EMT, angiogenesis or secretion of exosomal vesicles.

Ο καρκίνος του μαστού είναι μια ετερογενής ασθένεια που αποτελεί τον πιο συχνά εμφανιζόμενο καρκίνο στις γυναίκες ετησίως. Η Ετερογένεια αφορά την προέλευση των κυττάρων, τον συνδυασμό των «οδηγών» μεταλλάξεων, την κλωνική και επιγενετική επιλογή, που αντικατοπτρίζονται στην φαινοτυπική ποικιλομορφία, την απόκριση στη θεραπεία και την κλινική έκβαση του ασθενή. Αυτοί οι παράγοντες επηρεάζουν τον ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη συχνότητα και τη θέση των μεταστάσεων και την αντίσταση στη θεραπεία. Η ετερογένεια, που προκύπτει από γενετικές και επιγενετικές αλλαγές, μπορεί επίσης να αναπτυχθεί με την πάροδο του χρόνου εντός του ίδιου υποτύπου ή ακόμη και του ίδιου όγκου, καθιστώντας έτσι τις στοχευμένες εξατομικευμένες προσεγγίσεις υψηλή προτεραιότητα για την επίτευξη αποτελεσματικών θεραπειών. Για αυτό τον σκοπό, η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη βιολογική και κλινική συμπεριφορά του όγκου είναι υψίστης σημασίας. Η πρωτεΐνη της προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (PML) είναι ο βασικός οργανωτής πυρηνικών δομών που διευκολύνουν διάφορες αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις βασικών ρυθμιστικών παραγόντων που μεσολαβούν σε πολλαπλά επίπεδα στην επιβίωση των κυττάρων. Η PML ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά σε σύντηξη με τον υποδοχέα RARa, την πρωτεΐνη PML-RARa, που προκαλεί την οξεία μυελοκυτταρική λευχαιμία. Επόμενες μελέτες απέδωσαν στην PML ογκοκατασταλτικές ιδιότητες που προκαλούνται από προ-αποπτωτικά, προ-γηραντικά και ανασταλτικά σήματα του κυτταρικού κύκλου, σε συνδυασμό με την έλλειψη έκφρασης της σε δείγματα πρωτοπαθών όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού. Ωστόσο, πιο πρόσφατες μελέτες, αποκάλυψαν ότι, με τρόπο που εξαρτάται από το περιβάλλον, το PML μπορεί επίσης να εμφανίζει προ-ογκογονικές ιδιότητες. Συγκεκριμένα, στη χρόνια μυελοειδή λευχαιμία (CML), σε γλοιοβλαστώματα (GBM) και σε ορισμένες περιπτώσεις τριπλού αρνητικού καρκίνου του μαστού (TNBC), το PML εκφράζεται έντονα, βοηθώντας στη διατήρηση του καρκινικού πληθυσμού, είτε ρυθμίζοντας τον κυτταρικό κύκλο, είτε συμβάλλοντας στη ρύθμιση της αυτοανανέωσης των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου. Κατά συνέπεια, η PML έχει διπλό ρόλο στην ογκογένεση που ενεργεί ως κατασταλτικός παράγοντας ή ως προογκογόνος σε συγκεκριμένα κυτταρικά υπόβαθρα. Ο σκοπός αυτής της διατριβής ήταν να αποσαφηνίσει τους μοριακούς στόχους, μέσω των οποίων, η PML ρυθμίζει τη βλαστικότητα και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του μαστού ως ένα πρώτο βήμα για την κατανόηση του ρόλου των μοριακών στόχων που καθορίζουν την προ-ή αντι-ογκογονική δράση του. Στο πλαίσιο αυτό έγινε αποσιώπηση του PML γονιδίου σε χαρακτηρισμένα ανθρώπινα καρκινικά κυτταρικά μοντέλα του μαστού. Τα πειραματικά μας αποτελέσματα έδειξαν ότι η αποσιώπηση της PML ενισχύει την κινητικότητα των κυττάρων και τα μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά τους σε κυτταρικές καλλιέργειες, καθώς επίσης αύξησε την επιθετική συμπεριφορά των MDA-MB-231 κυττάρων, δημιουργώντας μεγαλύτερους όγκους και περισσότερες μεταστάσεις, αλλά όχι στα επιθηλιακά ER θετικά MCF7 κύτταρα. Τα αποτελέσματα της ιστολογικής ανάλυσης δείχνουν έμμεσα την υψηλότερη αγγείωση των όγκων PML-KD μια επίδραση που μπορεί να προκαλείται από ενισχυμένη απόκριση στην υποξία. Πιο σημαντικά, οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από πρωτογενείς όγκους in vivo ή μεταστάσεις του πνεύμονα, είναι περισσότερο επιθετικές και έχουν ενισχυμένες προαγγειογόνες ιδιότητες που μπορεί να προκύψουν από επιγενετική ή εκτεταμένη κλωνική επιλογή in vivo απουσία PML. Η PML αλληλεπιδρά με παράγοντες στόχους της p53 πρωτεΐνης, όπως παράγοντες της επιθηλιομεσεγχυματικής μετάβασης (EMT) και ο βασικός ρυθμιστής της υποξίας HIF1a, ρυθμίζοντας τη δράση τους σύμφωνα με το γενετικό υπόβαθρο των κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε διάφορους bHLH παράγοντες που περιλαμβάνουν τον HIF1a και τους EMT, όπως το Twist και το Snail, να αλληλεπιδρούν με την PML και πιθανότατα παρεμποδίζονται να προκαλέσουν EMT. Έτσι, η PML εμποδίζει την επιθετική EMT-μεταστατική συμπεριφορά των MDA-MB-231 αλλά όχι των κυττάρων MCF7 που δεν εκφράζουν EMT παράγοντες ή ιδιότητες. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, το μεταγραφικό προφίλ αυτών των κυττάρων αποκαλύπτει ότι σημαντικές βιολογικές λειτουργίες όπως η κυτταρική προσκόλληση, ο κυτταρικός κύκλος και τα σηματοδοτικά μονοπάτια που σχετίζονται με την κυτταρική μετάσταση απορρυθμίζονται από την αποσιώπηση της PML στα MDA-MB-231 αλλά όχι στα MCF7 κύτταρα.Ένας κοινός σύνδεσμος στα παραπάνω αποτελέσματα μπορεί να είναι η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53. Η φυσιολογική p53 ενεργοποιείται και δεσμεύεται από την PML σε συνθήκες κυτταρικού στρες για να ενεργοποιήσει την κυτταρική γήρανση και την αποπτωτική λειτουργία. Εμείς δείχνουμε ότι το PML δεσμεύει πολύ ισχυρότερα τις μεταλλαγμένες μορφές του p53, όπως είναι και στα MDA-MB-231 (R280K) σε σχέση με τη φυσιολογική p53 που υπάρχει στα MCF7 κύτταρα. Δεδομένου ότι η μεταλλαγμένη p53 είναι έχει ισχυρά ογκογόνο δράση, υποθέτουμε ότι το PML είναι ένα λειτουργικό εμπόδιο στην ογκογόνο δράση της μεταλλαγμένης p53, όπως υποδεικνύεται από δεδομένα επιβίωσης της TCGA βάσης δεδομένων που συσχετίζουν την υψηλή έκφραση της PML με καλύτερη πρόγνωση σε ασθενείς με μεταλλαγμένη p53 σε περιπτώσεις TNBC καρκίνου του μαστού, αλλά όχι στις περιπτώσεις που η p53 ήταν φυσιολογική. Η αποσιώπηση της PML μπορεί έτσι να απελευθερώνει τη δραστικότητα της μεταλλαγμένης p53 για να προάγει τη μετάσταση μέσω EMT, αγγειογένεσης ή έκκρισης εξωσωμικών κυτταρικών κυστιδίων.