Επιγενετικοί μηχανισμοί γονιδιακής σήμανσης κατά τη μίτωση

Abstract

The MHCII genes of the major histocompatibily complex play an importantrole in immune response. Their regulation implicates proteins that synergistically bindto the promoter and constitute the MHCII enhanceosome (MCE). Although necessary,MCE is not sufficient to drive transcription. The master coactivator CIITA is requiredfor efficient transcription initiation and elongation. This study approaches theregulation of MHCII genes through the cell cycle and particular during mitosis. Theexistence of gene bookmarking was examined, an important process for the cell inorder to maintain the gene expression profile to the next cell cycle.Immunostaining experiments for components of MCE showed theirassociation on mitotic chromatin in a dynamic manner, although with variable kineticsin different stages of the cell cycle. After the synchronization of a B lymphocyteculture and chromatin immunoprecipitation assays in different cell cycle stages werestudied the kinetics of the recruitment of different regulatory factors on the DRApromoter, a prototypical MHCII gene. The recruitment of the regulatory factors wasalso identified in a better defined mitotic environment.To compare the identified bookmarking mechanism in non-lymphoblastoidcells, epithelial cells, modified to express MHCII genes constitutively, were used.Chromatin immunoprecipitation assays were showed that mitotic occupancy of thefactors on the DRA promoter was diminished, and so does the accessibility, comparedto B lymphocytes. Furthermore transcription was abolished contrary to B lymphocytethat it maintained in low levels and can be fully rescued even by providing CIITAinside mitosis.Also, another regulatory element of the DRA gene, LCR/XL4 was studied.Results showed the mitotic occupancy of the NFY complex on this region and therecruitment of a phosphatase, PP2A, through interaction with NFYA transcriptionfactor. Then, with PP2A knocking down was identified that PP2A bookmarks theDRA gene, through chromatin decondensation, for transcription timing upon entryinto the G1 phase of the cell cycle. Finally, chromatin decondensation could rescuethe DRA expression in epithelial cells during mitosis.

Τα MHCII γονίδια του κυρίου συμπλόκου ιστοσυμβατότητας παίζουνσημαντικό ρόλο στην ανοσολογική απόκριση. Η ρύθμιση τους εμπλέκει πρωτεΐνες οιοποίες δρώντας συνεργατικά συγκροτούν το ενισχυόσωμα των MHCII (MCE). ΤοMCE δεν είναι αρκετό για την ενεργοποίηση τους, απαιτείται η παρουσία του CIITA,που αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή των MHCII γονιδίων. Η παρούσα εργασίαπροσεγγίζει την ρύθμιση των MHCΙΙ γονιδίων κατά τη διάρκεια του κυτταρικούκύκλου και συγκεκριμένα κατά τη μίτωση. Μελετήθηκε η ύπαρξη γονιδιακήςσήμανσης, μια σημαντική διαδικασία για το κύτταρο προκειμένου να διατηρήσει τοπρότυπο έκφρασης των γονιδίων του στον επόμενο κυτταρικό κύκλο.Mε πειράματα ανοσοφθορισμού για παράγοντες του MCE παρατηρήθηκε οεντοπισμός τους στη μιτωτική χρωματίνη, ενώ η μελέτη της κινητική τους έδειξε ότιη πρόσδεση τους είναι δυναμική. Μετά από συγχρονισμό μιας καλλιέργειας Β-λεμφοκυττάρων και με ανοσοκατακριμνήσεις χρωματίνης σε διάφορες φάσεις τουκυτταρικού κύκλου μελετήθηκε η κινητική της πρόσδεσης διαφόρων ρυθμιστικώνπαραγόντων στον υποκινητή του DRA γονιδίου, ενός πρότυπου MHCII γονιδίου. Ηπρόσδεση των παραγόντων αυτών ταυτοποιήθηκε και σε αμιγώς μιτωτικό πληθυσμό.Θέλοντας να συγκρίνουμε τον μηχανισμό γονιδιακής σήμανσης και σε έναάλλο κυτταρικό περιβάλλον χρησιμοποιήθηκαν επιθηλιακά κύτταρα που εξέφραζαντα MHCII συστατικά. Με ανοσοκατακριμνήσεις χρωματίνης δείχτηκε ότι σταμιτωτικά κύτταρα δεν παρατηρείται πρόσδεση των παραγόντων στον υποκινητή ενώκαι η προσβασιμότητα του ήταν περιορισμένη σε σχέση με των Β-λεμφοκυττάρων.Επίσης, παρατηρήθηκε ότι στα πρώτα η μεταγραφή μηδενιζόταν στη μίτωση σεαντίθεση με τα δεύτερα, που τη διατηρούσαν σε χαμηλά επίπεδα και μετά απόεπαγωγή του CIITA στη μίτωση επανερχόταν στα μεσοφασικά επίπεδα.Στη συνέχεια μελετήθηκε μια άλλη ρυθμιστική περιοχή του DRA γονιδίου, τοLCR/XL-4. Με ανοσοκατακριμνήσεις χρωματίνης ταυτοποιήθηκε η πρόσδεση τουNFY συμπλόκου στην περιοχή αυτή και η στρατολόγηση της φωσφατάσης PP2Aμέσω αλληλεπίδρασης της με τον NFYA. Έπειτα, με αποσιώπηση της PP2Aαποδείχθηκε ότι σημαίνει το DRA γονίδιο, μέσω αποσυμπύκνωσης της χρωματίνης,για την ταχύτερη επανέκφραση του στην επόμενη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου.Τέλος, παρατηρήθηκε ότι η αποσυμπύκνωση της χρωματίνης αποκαθιστά τηνέκφραση του DRA γονιδίου στα επιθηλιακά κύτταρα κατά τη μίτωση.