Διερεύνηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν τη δραστικότητα και υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1

Abstract

SRPK1, the prototype of serine-arginine protein kinases, has been implicated in a variety of cellular processes, such as constitutive and alternative splicing of mRNA, hetechromatin association with the nuclear envelope and replacement of histones by protamine 1 during spermiogenesis. According to the current model, the spacer domain of SRPK1 acts as a cytoplasmic anchor as it binds to the Hsp70/Hsp90 complex, which may initially assist folding the kinase into an active conformation but also restricts it to the cytoplasm. This interaction could be modified by a stress signal resulting in alteration of the subcellular distribution of the kinase, via currently unknown machinery. In this study, we attempted to shed light into the regulatory mechanisms that dictate SRPK1 translocation to the nucleus and elucidate the role of the spacer domain in SRPK1 structural configuration and activity. We demonstrated that treatment of HeLa cells with genotoxic agents, and especially 5-fluorouracil, results in almost complete translocation of both endogenous and transfected SRPK1 to the nucleus. According to a motif-profile scoring algorithm threonine 326 and serine 408 are considered as potential sites targeted by DNA-PK. Mutation of either of these two sites hampered SRPK1 translocation to the nucleus under genotoxic stress. Furthermore, substitution of threonine 326 and serine 408 with aspartic acid, which mimics phosphorylation, did not result in nuclear translocation of SRPK1 suggesting that an additional modification is also required. Initial molecular dynamics studies provided evidence that intramolecular disulfide bonds could form within the spacer domain of SRPK1. Using systematic mutagenesis of cysteine residues we showed that such bonds within the spacer domain and its flanking regions have an impact on the activity of the kinase. Furthermore, the cysteine residues are critical for nuclear translocation of SRPK1 in response to genotoxic stress and SRPK1-dependent splicing of a reporter gene. These findings suggest that a network of intramolecular disulfide bonds appears to be necessary for SRPK1 to adopt an active conformation which is a prerequisite for the nuclear translocation of the kinase, leading to regulated splicing in the nucleus. Finally, we provide evidence that Akt kinases directly phosphorylate an RS domain-containing protein with a clearly distinct specificity than SRPK1.

Η πρωτεϊνική κινάση SRPK1, το πιο μελετημένο μέλος της οικογένειας των SR πρωτεϊνικών κινασών, παίζει καθοριστικό ρόλο σε μια σειρά από κυτταρικές λειτουργίες όπως το μάτισμα των mRNA, η πρόσδεση της ετεροχρωματίνης στον πυρηνικό φάκελλο και η αντικατάσταση των ιστονών από την πρωταμίνη 1 κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης. Σύμφωνα με το ισχύον μοντέλο, η συνδετική περιοχή της SRPK1 λειτουργεί ως «κυτταροπλασματική άγκυρα» αφού δεσμεύεται στο σύμπλοκο των σαπερονινών Hsp70/Hsp90, το οποίο πιθανά αρχικά βοηθάει την κινάση να πάρει την ενεργή της διαμόρφωση και επιπλέον την ακινητοποιεί στο κυτταρόπλασμα. Με άγνωστο μέχρι στιγμής μηχανισμό, κάτω από συνθήκες στρες, η αλληλεπίδραση αυτή παύει να υφίσταται με αποτέλεσμα τη μεταβολή της υποκυτταρικής εντόπισης της κινάσης. Στην παρούσα εργασία, προσπαθήσαμε να διαλευκάνουμε τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν τη μετατόπιση της SRPK1 στον πυρήνα αλλά και το ρόλο που παίζει η συνδετική περιοχή τόσο στη δομή όσο και στη δραστικότητα της κινάσης. Δείξαμε, λοιπόν, ότι κατεργασία των HeLa κυττάρων με γενοτοξικούς παράγοντες, και κυρίως με 5-φλουοουρακίλη (5-fluorouracil, 5-FU), οδηγεί σε σχεδόν καθολική μετατόπιση τόσο της ενδογενούς όσο και της υπερεκφρασμένης SRPK1 στον πυρήνα των κυττάρων. Σύμφωνα με πρόγραμμα πρόβλεψης θέσεων φωσφορυλίωσης η θρεονίνη 326 και η σερίνη 408 της συνδετικής αλληλουχίας της SRPK1 αποτελούν πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την DNA-PK. Αντικατάσταση αυτών των δύο αμινοξέων με αλανίνη είχε ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της μετατόπισης της SRPK1 στον πυρήνα μετά από γενοτοξικό στρες. Επιπλέον, αντικατάσταση της θρεονίνης 326 και της σερίνης 408 με ασπαραγινικό οξύ, δεν οδήγησε σε μετατόπιση της SRPK1 στον πυρήνα έτσι υποθέτουμε ότι και κάποια άλλη τροποποίηση, εκτός της φωσφορυλίωσης είναι απαραίτητη. Προκαταρκτικές μελέτες μοριακής δυναμικής έδειξαν ότι υπάρχει πιθανότητα σχηματισμού δισουλφιδικού δεσμού μεταξύ των κυστεϊνών της συνδετικής αλληλουχίας της SRPK1. Αντικαθιστώντας όλες τις κυστεΐνες της συνδετικής αλλά και των παρακείμενων περιοχών με γλυκίνη δείξαμε ότι ο σχηματισμός δισουλφιδικού(ών) δεσμού(ών) επηρεάζει σημαντικά τη δραστικότητα της κινάσης. Επιπλέον, δείχθηκε ότι οι κυστεΐνες είναι καθοριστικές για την είσοδό της SRPK1 στον πυρήνα, μετά από επίδραση γενοτοξικού στρες, αλλά και για το μάτισμα ενός γονιδίου αναφοράς. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν πως είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός δικτύου εσωτερικών δισουλφιδικών δεσμών έτσι ώστε η SRPK1 να πάρει την ενεργή της διαμόρφωση, γεγονός που αποτελεί αναγκαία προϋπόθεση για να μπορέσει να μετακινηθεί στον πυρήνα και κατ’ επέκταση να ρυθμίσει τη διαδικασία του ματίσματος. Τέλος, δείξαμε ότι οι Akt κινάσες φωσφορυλιώνουν άμεσα τις πρωτεΐνες που περιέχουν SR ακολουθία και μάλιστα με διαφορετική εξειδίκευση από την SRPK1.