Μελέτη του μηχανισμού ρύθμισης της ρετρομετάθεσης σε νευρογλοιακά κύτταρα

Abstract

HERVs (Human Endogenous Retroviruses) are considered as LTR-retrotransposons able to produce extra copies in the genome using a ‘copy and paste’ mechanism. They comprise ~8% of the human genome and may influence chromosome integrity as well as gene expression upon their retrotransposition. Glioma, is the most common malignant cancer, accounting for >60% of primary brain tumors and displays high degree of phenotypic, genetic, epigenetic, proliferative, metastatic, tumorigenic and resistance heterogeneity. Some of these characteristics are attributed to Cancer Stem Cells (CSCs), which may derive either from an increased symmetric self-renewal division rate of CSCs or a reprogramming of non-CSCs to CSCs.Aim of the present dissertation was to investigate three crucial questions, whether: 1. retrotransposition events occur in human glioma cells, 2. the outcome of retrotransposition is associated with major cellular events, commonly characterizing the human gliomas, such as phenotypic heterogeneity, cell proliferation disturbances, tumorigenisity and metastasis, and 3. retrotransposition in human gliomas is under epigenetic or other regulation mechanisms.The main findings of the present research were the following:- Τransfection of the non-autonomous, LTR-retrotransposon HERV-K10 in human U-373 and U-87 glioma cells produced high retrotransposition frequencies in both cell lines, indicating that human glioma cells represent a favorable environment for retrotransposition occurrence.- HERV-K10 retrotransposition is correlated with: a. astrocytic differentiation of U-373 progenitor cells, b. U-87 astroglial cells transdifferentiation/reprogramming into a neuronal phenotype. These findings were confirmed through morphological examination of the resultant phenotype and molecular identification of specific astrocytic (GFAP-positive cells) and neuronal (βIII-tubulin) differentiation markers. We also found that retrotransposition-positive cells exhibited lower proliferative rates compared to parental cells, accompanied by extended cell cycle disturbances in both cell lines in addition to hyperploidy (tetraploidy) development in U-87 cells. Finally, the induction of retrotransposition frequency by the differentiation factor retinoic acid, provides another strong support to our hypothesis that retrotransposition is correlated to glioma cells differentiation.- HERV-K10-induced reprogramming of U-87 cells took place through de-differentiation into an intermediate progenitor/stem cell stage (Cancer Stem Cells, CSCs). In particular, retrotransposition-positive U-87 cells were able to form a large number of robust neurospheres, which expressed stem cell markers (nestin, Sox2, Oct-4 and CD133). Neurospheres were able to renew and differentiate into the two main lineages (astrocytes and neurons) of the nervous tissue, indicating the cancer stem cells formation.- The formation of retrotransposition-induced cancer stem cells was characterized by an in vitro increased tumorigenic and metastatic potential. - On the basis of the regulatory mechanisms of HERV-K10 retrotransposition in human glioma cells, we showed that: a. treatment of U-373 or U-87 cells with drugs exerting epigenetic activity such as the histone deacetylase inhibitor, valproic acid (VPA) or DNA methyltrasferase inhibitor, 5΄-aza-2-deoxycytidine, induced retrotransposition frequency, b. epigenetically induced-retrotransposition was correlated with glioma cells differentiation as well as cell cycle arrest. - Finally, we discovered that both VPA-induced retrotransposition and retrotransposition-induced differentiation of glioma cells were inhibited by the reverse transcriptase inhibitor, efavirenz.Conclusively, the present study provides, for the first time, experimental evidence correlating major cellular events characterizing human gliomas, such as phenotypical heterogeneity, cell proliferation disturbances, tumorigenicity and metastasis with the phenomenon of HERV-K10 provirus retrotransposition. Additionally, it highlights that the regulation of retrotransposition through epigenetic mechanisms or reverse transcription inhibition, may influence the direction of glioma cells differentiation, which is considered to be a very important stage of brain tumors initiation and progression.

Οι ανθρώπινοι ενδογενείς ρετροϊοί (HERVs) θεωρούνται LTR-ρετροτρανσποζόνια ικανά να εισάγουν νέα τους αντίγραφα μέσω ενός μηχανισμού «αντιγραφής & ενσωμάτωσης». Αποτελούν το ~8% του ανθρώπινου γενώματος και δύνανται να επηρεάσουν την χρωμοσωμική ακεραιότητα όπως και την γονιδιακή έκφραση μετά την ρετρομετάθεσή των. Το γλοίωμα είναι ο πιο κοινός και επιθετικός ανθρώπινος τύπος καρκίνου, αποτελώντας το 60% όλων των περιπτώσεων πρωτογενών εγκεφαλικών όγκων. Χαρακτηρίζεται από έντονη ετερογένεια σε πολλαπλά επίπεδα που αφορούν στον φαινότυπο, στην γενετική και επιγενετική τους κατάσταση, στο δυναμικό πολλαπλασιασμού, μεταναστευτικότητας, ογκογενετικότητας και ανθεκτικότητάς τους. Πολλές από αυτές τις ιδιότητες αποδίδονται στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (Cancer Stem Cells: CSCs) τα οποία μπορούν να προκύψουν είτε μέσω αυξημένου αριθμού συμμετρικών κυτταρικών διαιρέσεων των CSCs είτε μέσω επαναπρογραμματισμού των μη-CSCs σε CSCs.Σκοπό της διατριβής αυτής αποτέλεσε η διερεύνηση τριών κρίσιμων ερωτημάτων, εάν: 1. γεγονότα ρετρομετάθεσης λαμβάνουν χώρα σε ανθρώπινα γλοιωματικά κύτταρα, 2. οι επιπτώσεις της ρετρομετάθεσης συσχετίζονται με μείζονα κυτταρικά φαινόμενα που απαντώνται σε γλοιωματικούς όγκους όπως είναι η φαινοτυπική ετερογένεια, το δυναμικό πολλαπλασιασμού, η ογκογενετικότητα και μεταστατικότητα και 3. η ρετρομετάθεση υπόκειται σε επιγενετικούς ή άλλους μηχανισμούς ρύθμισης σε γλοιωματικά κύτταρα.Τα κυριότερα ευρήματα της παρούσας διδακτορική διατριβής είναι τα ακόλουθα: - H διαμόλυνση δύο ανθρώπινων γλοιωματικών κυτταρικών σειρών (U-373- και U-87 MG) με το μη-αυτόνομο, LTR-ρετροτρανσποζόνιο, HERV-K10 οδήγησε στην παραγωγή υψηλής συχνότητας ρετρομετάθεσης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.- H ρετρομετάθεση HERV-K10 σε προγονικά γλοιωματικά κύτταρα U-373 συσχετίζεται με φαινόμενα διαφοροποίησής των προς ώριμα αστροκύτταρα που στοιχειοθετήθηκε τόσο μορφολογικά, όσο και μοριακά, μέσω ταυτοποίησης του πρωτεϊνικού δείκτη αστροκυτταρικής διαφοροποίησης GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein).- Η ρετρομετάθεση HERV-K10 επήγαγε φαινόμενα κυτταρικού επανα-προγραμματισμού αστροκυττάρων U87 προς νευρικού τύπου κύτταρα τα οποία απώλεσαν πλήρως την έκφραση της GFAP και συγχρόνως εμφανίστηκαν ισχυρά θετικά στην έκφραση της βIII-τουμπουλίνης (δείκτης χαρακτηρισμού νευρικών κυττάρων).- Ο HERV-K10-επαγόμενος επαναπρογραμματισμός επετεύχθη έμμεσα, μέσω από-διαφοροποίησής προς ένα ενδιάμεσο προγονικό/βλαστικό στάδιο (ενεργοποίηση CSCs). Πιο ειδικά, αποδείχθηκε ότι τα θετικά ρετρομετάθεσης κύτταρα U87 ήταν ικανά να παράξουν νευρόσφαιρες, οι οποίες: α. εξέφραζαν πρωτεϊνικούς δείκτες βλαστικότητας (νεστίνη, Sox2, Oct-4 και CD133) και β. έφεραν τις ιδιότητες της αυτό-ανανέωσης και του πολλαπλού δυναμικού διαφοροποίησης (αστρογλοιακή και νευρωνική γενεαλογία). - Η επαγωγή των CSCs σε κύτταρα U-87, οδήγησε σε in vitro ενίσχυση του ογκογενετικού και μεταστατικού τους δυναμικού, παρατηρήσεις που σημειώθηκαν και σε κύτταρα U373-θετικά ρετρομετάθεσης.- Επιπρόσθετη απόδειξη της συντελούμενης κυτταρικής διαφοροποίησης αποτέλεσε η σημαντική μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των θετικών ρετρομετάθεσης κυττάρων, που συνοδεύτηκε από εκτεταμένες διαταραχές του κυταρικού τους κύκλου.- Η επαγωγή της ρετρομετάθεσης HERV-K10 ως αποτέλεσμα της επίδρασης γλοιωματικών κυττάρων με τον παράγοντα κυτταρικής διαφοροποίησης, ρετινοϊκό οξύ, συνεπικουρεί στην εμπλοκή του φαινομένου της ρετρομετάθεσης στην διαφοροποίηση των γλοιωματικών κυττάρων.- Σε επίπεδο ρύθμισης της ρετρομετάθεσης HERV-K10 σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιώματος, αποδείξαμε ότι: η επαγωγή της ρετρομετάθεσης από βαλπροϊκό οξύ και 5΄-αζακυτιδίνη συσχετίζονται με φαινόμενα κυτταρικής διαφοροποίησης και αναστολής του κυτταρικού κύκλου. - Η αναστολή της επαγόμενης από βαλπροϊκό οξύ ρετρομετάθεσης με την χρήση αναστολέων των ενδογενών αντίστροφων μεταγραφασών (Efavirenz), αποτρέπει την συντελούμενη από το βαλπροϊκό οξύ κυτταρική διαφοροποίηση. Η παρούσα μελέτη φιλοδοξεί να παρουσιάσει μία νέα πτυχή/διάσταση γύρω από τα κυριότερα κυτταρικά φαινόμενα που χαρακτηρίζουν/απαντώνται στα ανθρώπινα γλοιώματα, τοποθετώντας την ρετρομετάθεση στο επίκεντρο του γενικότερου μηχανισμού ρύθμισής των.