Γενετική και μοριακή μελέτη της ετεροκαρύωσης στον φυτοπαθογόνο μύκητα Verticillium

Abstract

Anastomosis of conidia or hyphae is the first step towards the establishment of heterokaryons and the parasexual cycle in ascomycetes. This process, however, is often hampered in natural populations of fungi by vegetative or heterokaryon incompatibility systems. The asexual plant pathogenic ascomycetes of the genus Verticillium are characterized by great ecological and economic worldwide significance. Based on complementation testing of nit mutants (in the nitrate assimilation pathway), strains of these fungi are classified to Vegetative Compatibility Groups (VCGs), which are traditionally considered to comprise genetically homogeneous and isolated subspecific groups. The goal of this work was to study heterokaryosis/heterokaryon incompatibility mainly in V. dahliae with population, genetic, cell biology, genomic and molecular-functional experimental approaches. With these methods, (i) new molecular tools were developed for the rapid and accurate molecular prediction of V. dahliae VCGs, (ii) a new methodology was developed for the nit mutants-based high-throughput VCG classification of fungal strains, (iii) it was found that V. dahliae VCGs are not genetically homogeneous and absolute genetic barriers are absent between VCGs, (iv) a marked impact of the genetic method and the markers used on the VCG classification of strains was determined, (v) fusion of conidia via conidial anastomosis tubes was studied under different environmental conditions, and it was shown that nuclei can migrate through anastomosis bridges in Verticillium, resulting in the formation of heterokaryons, (vi) it was found that hyphae of incompatible V. dahliae strains exhibit a mutual tolerance behavior leading to incompatible anastomoses and heterokaryons, which are then rapidly isolated and led to cell death, (vii) Verticillium homologs of known heterokaryon incompatibility genes were identified and all genes of these fungi with putatively relevant domains were identified and in silico analyzed, (viii) efficient methods for the genetic transformation of V. dahliae were optimized and employed for the functional study of het-c1, het-c2, un-24, vib-1, hex-1 and MAT1-2-1 genes through the construction of gene knock-out deletion mutants; several phenotypic alterations both in the compatibility behavior and fundamental morphogenetic/physiological processes were recorded.

Ο παραφυλετικός κύκλος στους ασκομύκητες ξεκινά με την αναστόμωση σπορίων ή υφών διαφορετικών γονοτύπων προς σχηματισμό ετεροκαρύων, ο οποίος ωστόσο συχνά παρεμποδίζεται στους φυσικούς πληθυσμούς από συστήματα ετεροκαρυωτικής ασυμβατότητας. Οι αφυλετικοί φυτοπαθογόνοι μύκητες του γένους Verticillium έχουν μεγάλη οικολογική και οικονομική σημασία διεθνώς. Βάσει της μεθόδου συμπληρωματικότητας μεταλλαγών nit (στο μονοπάτι αφομοίωσης των νιτρικών ιόντων) τα στελέχη των μυκήτων κατατάσσονται σε Ομάδες Βλαστητικής Συμβατότητας (Vegetative Compatibility Groups, VCGs), οι οποίες θεωρείται παραδοσιακά πως αποτελούν γενετικά ομοιογενείς και απομονωμένες ενδοειδικές υποομάδες. Ο στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της ετεροκαρύωσης/ετεροκαρυωτικής ασυμβατότητας κυρίως στο είδος V. dahliae με παράλληλες προσεγγίσεις πληθυσμιακής βιολογίας, γενετικής, κυτταρικής βιολογίας-φυσιολογίας και μοριακής βιολογίας-γονιδιωματικής ανάλυσης. Με αυτές τις μεθόδους (α) αναπτύχθηκαν νέα μοριακά εργαλεία για την ταχεία και αξιόπιστη πρόβλεψη της κατάταξης πληθυσμών του μύκητα σε VCGs, (β) αναπτύχθηκε νέα μεθοδολογία μεγάλης κλίμακας για την κατάταξη στελεχών του μύκητα σε VCGs με βάση τη συμπληρωματικότητα μεταλλαγών nit, (γ) αποδείχθηκε πως οι VCGs του V. dahliae δεν είναι γενετικά ομοιογενείς ομάδες και ότι δεν υφίστανται απόλυτοι γενετικοί φραγμοί μεταξύ αυτών, (δ) αποδείχθηκε πως οι εκάστοτε γενετικοί δείκτες που χρησιμοποιούνται για την κατάταξη στελεχών σε VCGs επιδρούν καθοριστικά στα αποτελέσματα της κατάταξης, (ε) μελετήθηκε η αναστόμωση κονιδίων του μύκητα σε φάση βλάστησης και η επίδραση φυσιολογικών παραμέτρων στη διαδικασία, και αποδείχθηκε πως η διέλευση πυρήνων μέσω αναστομώσεων προς δημιουργίαν ετεροκαρύων είναι δυνατή στο Verticillium, (στ) βρέθηκε ότι ο κύριος φαινότυπος ασυμβατότητας στο V. dahliae συνίσταται στην αμοιβαία «ανοχή» και σύντηξη των ασύμβατων υφών προς σχηματισμό ασύμβατων ετεροκαρύων, τα οποία υποβάλλονται σε απομόνωση και καταστροφή, (ζ) στα γονιδιώματα των ειδών του Verticillium εντοπίσθηκαν γονίδια με ομολογία προς γνωστά γονίδια ετεροκαρυωτικής ασυμβατότητας, καθώς και άλλα που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες με πιθανώς σχετιζόμενα μοτίβα, και (η) κατόπιν ανάπτυξης αποδοτικών συστημάτων γενετικού μετασχηματισμού του V. dahliae, επιλεγμένα γονίδια (het-c1, het-c2, un-24, vib-1, hex-1 και MAT1-2-1) μελετήθηκαν λειτουργικά μέσω στοχευμένης γονιδιακής απαλοιφής, αποκαλύπτοντας πληθώρα λειτουργιών σχετικών τόσο με την ετεροκαρυωτική ασυμβατότητα, όσο και με θεμελιώδεις μορφογενετικές και φυσιολογικές διαδικασίες.