Μελέτη των μηχανισμών εισόδου πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια

Abstract

Erv1 and Mia40 constitute the two important components of the disulfide relay system that mediates oxidative protein folding of the small Tim proteins and other cysteine rich substrates in the mitochondrial intermembrane space. The small Tims chaperone hydrophobic precursors across the mitochondrial intermembrane space. Tim9 and Tim10 form the soluble TIM10 complex that binds precursors exiting from the outer membrane. Tim12 functions downstream, as the only small Tim peripherally attached on the inner membrane. The aim of the first part of this study was to investigate the funvtion that renders Tim12 essential for the cell, and the domain via which it is mediated. It is shown that Tim12 has an intrinsic affinity for the lipids of the inner mitochondrial membrane. The C-terminal end of Tim12 is essential in vivo and it determines the interaction with the membrane and the assembly of the protein in complexes with the other Tims. The N-terminal end, is dispensable and it both contains targeting information and mediates direct binding of Tim12 to the substrates. These results provide a molecular basis for the concept that the essential role of Tim12 relies on its unique properties that allow it to act as a bridge for the soluble and membrane-embedded translocases in the carrier import pathway. Mia40 is the import receptor that recognizes the substrates that target the intermembrane space of mitochondria introducing disulfide bonds to promote their folding. A key function of Erv1 is to recycle Mia40 to its active oxidative state. The aims in the second part of this study, were to dissect the domain of Erv1 that mediates the interaction with Mia40 and to investigate the intamolecular communication of the two Erv1 domains. It is established that the N’ terminal flexible domain of Erv1 is necessary and sufficient for both the covalent and the non-covalent interaction with Mia40 to occur. Furthermore, we provide evidence for the intramolecular electron transfer from the shuttle cysteine pair of Erv1 to the catalytic core of the protein. The final part of this study focuses on the mitochondrial targeting of the bacterial toxin, EspF. EspF is injected from the type II secretion system of Enteropathogenic E. coli (EPEC) directly into the gut epithelial cell cytoplasm where it exerts its pathogenic role, which includes mitochondrial membrane potential disruption and cytochrome c release. It is shown that EspF is targeted specifically to yeast mitochondrial matrix and causes limited cystochrome c release, very early on. In the 8 mitochondrial matrix EspF interacts with the inner membrane. Co-purification studies showed that EspF interacts with 3 proteins of the matrix targeted import pathway. The most abundant protein partner identified is the mtHsp70. The model that is proposed for the pathogenic function of EspF, is that by blocking TIM23 import pathway during its import into the mitochondrial matrix, it causes depolarization of the inner membrane, and cytochrome c release.

Οι Mia40 και Erv1 αποτελούν δύο βασικά συστατικά του μηχανισμού οξειδωτικής αναδίπλωσης στο διαμεμβρανικό χώρο του μιτοχονδρίου, για υποστρώματα πρωτεΐνες πλούσιες σε κυστεΐνες όπως αυτές της οικογένειας των μικρών Tim. Οι μικρές πρωτεΐνες Tim, δρουν ως σαπερόνες συνοδεύοντας υδρόφοβα υποστρώματα που στοχεύουν την εσωτερική μεμβράνη, διαμέσου του υδατικού διαμεμβρανικού χώρου (μονοπάτι ΤΙΜ22). Η Tim12 είναι η μόνη πρωτεΐνη της οικογένειας που βρίσκεται περιφερειακά προσδεμένη με την εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. Σκοπός του πρώτου μέρους αυτής της μελέτης ήταν να αποδειχθεί η λειτουργία που καθιστά την Tim12 απαραίτητη για τη επιβίωση του κυττάρου. Αρχικά, δείχνεται, ότι η Tim12 έχει εγγενή συνάφεια για τα λιπίδια της εσωτερικής μεμβράνης. Το καρβοξυτελικό τμήμα της Tim12 είναι απαραίτητο για την επιβίωση του σακχαρομύκητα και καθορίζει τόσο την αλληλεπίδραση με την μεμβράνη, όσο και την ενσωμάτωση της Tim12 στα σύμπλοκα με τις άλλες πρωτεΐνες Tim. Το αμινοτελικό άκρο, δεν είναι απαραίτητο για την επιβίωση. Βρέθηκε να περιλαμβάνει πληροφορία για τη στόχευση της πρωτεΐνης στο μιτοχόνδριο, καθώς επίσης και να αλληλεπιδρά με τις διαμεμβρανικές περιοχές του υποστρώματος ScAAC. Τα παραπάνω αποτελέσματα, συνάδουν στο συμπέρασμα ότι ο σημαντικός ρόλος της Tim12 επαφύεται στην ιδιότητά της να δρα ως γέφυρα μεταξύ των διαλυτών και των μεμβρανοσύνδετων μετατοπασών, στο μονοπάτι εισόδου στην εσωτερική μεμβράνη, ΤΙΜ22. Η Mia40 είναι η οξειδάση / υποδοχέας που αναγνωρίζει τα υποστρώματα που στοχεύουν το διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων, προωθώντας την οξειδωτική αναδίπλωσή τους. Ένας βασικός ρόλος της Erv1 είναι να ανακυκλώνει την Mia40 στην ενεργή, οξειδωμένη μορφή της. Σκοπός του δεύτερου μέρους της διατριβής ήταν να μελετηθεί ο μοριακός μηχανισμός της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο αυτών πρωτεϊνικών παραγόντων καθώς και η μελέτη της ενδομοριακής επικοινωνίας μεταξύ των δύο τμημάτων της Erv1. Παρατηρήθηκε ότι το αμινοτελικό άκρο της Erv1 είναι αναγκαίο και ικανό τόσο για την ομοιοπολική όσο και για την μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση με τη Mia40. Επιπλέον, παρέχονται δεδομένα που υποδεικνύουν την ενδομοριακή ροή ηλεκτρονίων από το αμινοτελικό ευέλικτο άκρο της Εrv1 προς τον καταλυτικό πυρήνα της πρωτεΐνης. Το τρίτο και τελευταίο μέρος αυτής της μελέτης εστιάζει στην μιτοχονδριακή στόχευση της βακτηριακής τοξίνης EspF. Η EspF ενύεται από το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ του Enteropathogenic E. Coli (EPEC), μέσα στο κυτταρόπλασμα του επιθηλικού κυττάρου του εντέρου (ξενιστής), όπου προκαλεί μεταξύ άλλων, διακοπή του δυναμικού της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και απελευθέρωση κυτοχρώματος c. Στην παρούσα διατριβή δείχνεται ότι η EspF στοχεύεται ειδικά στη μιτοχονδριακή μήτρα του σακχαρομύκητα και 6 προκαλεί περιορισμένη απελευθέρωση κυτοχρώματος c, σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα. Στη μήτρα η EspF αλληλεπιδρά περιφερειακά με την εσωτερική μεμβράνη. Σε πειράμα συγκατακρήμνισης με στόχο την απομόνωση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την τοξίνη, φάνηκε ότι η EspF προσδένεται σε τρεις πρωτεΐνες του μονοπατιού εισόδου στη μήτρα, ΤΙΜ23. Η πιο άφθονη από αυτές είναι η σαπερόνη της μιτοχονδριακής μήτρας, mtHsp70. Το μοντέλο που προτείνεται για τον μοριακό μηχανισμό δράσης της τοξίνης EspF στο μιτοχόνδριο είναι ότι κατά τη διάρκεια της εισόδου της στο μιτοχόνδριο, συσσωρεύεται πάνω στη σαπερόνη mtHsp70 και παγιδεύει το κανάλι ΤΙΜ23 στην ‘ανοικτή’ διαμόρφωση, γεγονός που οδηγεί στην εκπόλωση της μεμβράνης και την επακόλουθη απελευθέρωση κυτοχρώματος c.