Μελέτη της επίδρασης ουσιών με μυκητοκτόνο-κυτταροτοξική δράση σε κυτταρικούς πληθυσμούς με εξειδικευμένα χαρακτηριστικά μέσω μετά-μεταγραφικής τροποποίησης αυτών για χρήση σε βιοαισθητήρες

Abstract

Oxidative stress is defined as a disturbance in the balance between theproduction of reactive oxygen species (free radicals) and antioxidant defenses. Freeradicals and reactive oxygen species are naturally occurring reactive compounds thatexert both positive and negative effects. To counteract the harmful effects, organismshave developed complex defense mechanisms that constitute the antioxidantresponse mechanisms. These mechanisms include antioxidant enzymes (CAT, GPx,SOD) and non-enzymatic antioxidants (vitamin C, GSH). The imbalance betweenfree radical production and antioxidant defenses leads an oxidative state, which isassociated with the process of aging and with pathological conditions such as cancerand Parkinson's disease.In recent years, xenobiotics-induced oxidative stress as a mechanism of toxicityhas been the subject of extensive research. The present study is focused on arelatively new class of xenobiotics, strobilurins, which act as inhibitors of cellularrespiration, disrupting the electron transport chain in mitochondria. Their mode ofaction, which is directly linked to ROS production in mitochondria, makes itnecessary to study their effect on the oxidative imbalance of mammalian cells. Forthis purpose, we studied the effect of kresoxim-methyl, one of the most widely usedstrobilurin fungicides, on the oxidative homeostasis in mammalian cells. Cells wereexposed to non-lethal doses of the fungicide, which coincide with the maximumresidue levels (MRLs) established for kresoxim-methyl in agricultural commodities.The cell lines used in our study, were N2a neuroblastoma cells and Vero renalfibroblasts. The effects of the fungicide were assessed through cell viability tests anda series of enzymatic and non-enzymatic markers of oxidative stress response andapoptosis. Both cell lines showed similar viability results against the fungicide, butresponded differently in terms of redox status.Furthermore, a cell-based biosensor was constructed, through the culture ofmammalian cells on the surface of the biocompatible and conductive polymerPEDOT. Cellular adhesion and viability of both cell lines on PEDOT were examined,followed by electrochemical studies of the electrode-cell configuration. Finally, Verocells were subjected to post translational modifications by silencing transcriptionfactor Nrf2. This attempt aimed to improve the sensitivity of the biosensor bycontrolling the expression of the detoxifying and antioxidant genes of Vero cells,which acted as the biorecognition element. The response of the cell biosensor washighly correlated with the number of cells and with the fungicide concentration. Themodified biosensor also exhibited increased sensitivity after application of posttranscriptionalsilencing to the biorecognition element.

Ο όρος οξειδωτικό στρες αναφέρεται στην κατάσταση, κατά την οποία ηισορροπία ανάµεσα στους οξειδωτικούς παράγοντες και την αντιοξειδωτική άµυναενός οργανισμού διαταράσσεται σηµαντικά υπέρ των πρώτων, οδηγώντας έτσι στηβλάβη των κυτταρικών συστατικών. Οι ελεύθερες ρίζες και οι ενεργές μορφέςοξυγόνου είναι δραστικές ενώσεις που παράγονται φυσικά και μπορούν να ασκήσουντόσο θετικές όσο και αρνητικές επιπτώσεις στα βιολογικά συστήματα. Για τονπεριορισμό των επιβλαβών επιπτώσεων, οι οργανισμοί διαθέτουν πολύπλοκασυστήματα προστασίας, τα αντιοξειδωτικά συστήματα. Αυτά τα συστήματααποτελούνται από αντιοξειδωτικά ένζυμα (CAT, GPx, SOD) και από μη-ενζυμικάαντιοξειδωτικά. Η διαταραχή μεταξύ της παραγωγής ελευθέρων ριζών και τηςαντιοξειδωτικής άμυνας οδηγεί σε μία οξειδωτική κατάσταση, που εμπλέκεται στηδιαδικασία της γήρανσης και σε παθολογικές καταστάσεις (π.χ. καρκίνος, ασθένειαParkinson).Τα τελευταία χρόνια το ξενοβιοτικά-επαγώμενο οξειδωτικό στρες, ως μηχανισμόςτοξικότητας, έχει γίνει αντικείμενο εκτεταμένης μελέτης. Η παρούσα εργασία εστίασεσε μια σχετικά νέα κατηγορία ξενοβιοτικών ουσιών, τις στρομπιλουρίνες, οι οποίεςδρουν ως παρεμποδιστές της κυτταρικής αναπνοής, διαταράσσοντας την αλυσίδαμεταφοράς ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια. Ο μηχανισμός δράσης τωνστρομπιλουρινών, ο οποίος συνδέεται άμεσα με την παραγωγή ROS από ταμιτοχόνδρια, καθιστά απαραίτητη τη μελέτη της επίδρασης τους στην οξειδωτικήισορροπία των κυττάρων. Για το σκοπό αυτό εκτιμήθηκε η επίδραση του kresoximmethyl,μιας από τις πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενες στρομπιλουρίνεςπαγκοσμίως, στην οξειδωτική ομοιόσταση κυττάρων θηλαστικών. Η έκθεση τουμυκητοκτόνο πραγματοποιήθηκε σε μη θανατηφόρες δόσεις, οι οποίες συμπίπτουνκαι με τα μεγίστα επιτρεπτά όρια (MRLs) που έχουν θεσπιστεί για τηνυπολειμματικότητα του σε αγροτικά προιόντα. Οι κυτταρικές σειρές που μελετήθηκανήταν τα κύτταρα νευροβλαστώματος N2a και οι νεφρικοί ινοβλαστες Vero, ενώδιενεργήθηκαν πειράματα κυτταρικής βιωσιμότητας και μετρήθηκαν μια σειρά απόενζυμικοί και μη-ενζυμικοί μηχανισμοί, που εμπλέκονται στις αντιδράσεις οξειδωτικούστρες και απόπτωσης. Οι δύο κυτταρικές σειρές αν και εμφάνισαν παρόμοιααποτελέσματα βιωσιμότητας έναντι του μυκητοκτόνου, έδωσαν διαφορετικέςαντιδράσεις σε ότι αφορά την οξειδοαναγωγική τους ισορροπία.Επιπλέον κατασκευάστηκε κυτταρικός βιοαισθητήρας που βασίστηκε στηνκαλλιέργεια κυττάρων στην επιφάνεια του βιοσυμβατού και αγώγιμου πολυμερούςPEDOT. Αρχικά εξετάστηκε η κυτταρική προσκόλληση και βιωσιμότητα των δύο κυτταρικών σειρών στο πολυμερές και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτηηλεκτροδίων PEDOT/κυττάρων μέσω ηλεκτροχημικών μεθόδων. Τέλος έγινεπροσπάθεια βελτίωσης της ευαισθησίας του βιοαισθητήρα μέσω ελέγχου τηςέκφρασης αποτοξινωτικών και αντιοξειδωτικών γονιδίων των κυττάρων Vero. Για τοσκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε μετα-μεταγραφική σίγηση του παράγοντα Nrf2 μέσωπαροδικής διαμόλυνσης και χρήση των τροποποιημένων κυττάρων ως βιολογικόστοιχείο αναγνώρισης του αισθητήρα. Ο κυτταρικός βιοαισθητήρας εμφάνισε υψηλήσυσχέτιση με τον αριθμό κυττάρων, αλλά και με την συγκέντρωση μυκητοκτόνου καιαύξησε την ευαισθησία του μετά την εφαρμογή της μετα-μεταγραφικής σίγησης,καταδεικνύοντας τη σημασία του τροποποιημένου στοιχείου βιοαναγνώρισης.