Μελέτη των πολυμορφισμών του κυτοχρώματος P450 και η επίδραση τους στη θεραπεία με αντιβιταμίνες K σε έλληνες ασθενείς

Abstract

Acenocoumarol is mainly catabolized by CYP2C9 isoform of cytochrome P450 (CYP) liver complex and exerts its anticoagulant effect through the inhibition of Vitamin K Epoxide Reductase (VKOR). The most important genetic polymorphisms which lead to an impaired enzymatic activity and therefore predispose to acenocoumarol sensitivity, are considered to be CYP2C9*2 (Arg144Cys), CYP2C9*3 (Ile359Leu) and VKORC1-1639G[A, respectively. The aim of this study was to identify the association of CYP2C9*2(Arg144Cys), CYP2C9*3(Ile359Leu) and VKORC1 -1639G>A polymorphisms with acenocoumarol mean maintenance dose in Greek patients and to compare the results of the PGX-Thrombo StripAssay kit (ViennaLab Diagnostics,Vienna, Austria) with direct DNA sequencing and in house Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) for the detection of the aforementioned Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). A retrospective cohort study was conducted to 98 patients who met the inclusion criteria and gave an informed consent. The CYP2C9*2 and VKORC1 -1639G>A allelic variants were analyzed by PCR-RFLP(Polymerase chain rection followed by restriction endonuclease digestion), while CYP2C9*3 was genotyped by direct sequencing of PCR products. The aformentioned polymorphisms were also analysed performing the PGX-Thrombo StripAssay kit (ViennaLab Diagnostics,Vienna, Austria) in 40 of the 98 patients. Allelic frequencies of CYP2C9*2, CYP2C9*3 and VKORC1A were found to be 0.155, 0.075 and 0.485, respectively. Carriership of at least one CYP2C9*3 allele led to the most pronounced reduction in the required mean dose (p < 0.0001). In contrast, the CYP2C9*2 allele played a minor role (p = 0.3). VKORC1 A/A patients needed approximately a third of the dose required by wild-type patients to achieve the target INR (p < 0.0001). Age was the only demographical factor significantly affecting acenocoumarol dose (p < 0.0001). In a multivariable regression model, CYP2C9, VKORC1 genotypes and age explained 55% of acenocoumarol dosing variability. Furthermore, the reverse hybridization StripAssay kit was found to be equally effective with RFLP and direct DNA sequencing for the detection of CYP2C9*2 and CYP2C9*3 polymorphisms, respectively. The comparison of the RFLP reference method with the reverse hybridization StripAssay for the detection of VKORC1-1639 G[A polymorphism showed that the reverse hybridization StripAsssay might misclassify some A/A homozygotes as heterozygotes...

Η ασενοκουμαρόλη καταβολίζεται κυρίως από το ισοένζυμό CYP2C9 του κυτοχρώματος Ρ450 (CYP) και εξασκεί την αντιπηκτική της δράση μέσω της αναστολής της of αναγωγάσης του εποξειδίου της Βιταμίνης Κ (VKOR). Οι πιο σημαντικοί γενετικοί πολυμορφισμοί που οδηγούν σε μειωμένη ενζυμική δραστηριότητα, προδιαθέτοντας σε ευαισθησία στην ασενοκουμαρόλη, θεωρούνται οι CYP2C9*2 (Arg144Cys), CYP2C9*3 (Ile359Leu) and VKORC1-1639G>A, αντίστοιχα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η συσχέτιση των πολυμορφισμών CYP2C9*2 (Arg144Cys), CYP2C9*3 (Ile359Leu) and VKORC1-1639 G>A με τη μέση δόση συντήρησης της ασενοκουμαρόλης σε Έλληνες ασθενείς και η σύγκριση των αποτελεσμάτων του εμπορικού kit PGX-Thrombo StripAssay kit (ViennaLab Diagnostics,Vienna, Austria) με την άμεση ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του DNA (Direct Sequencing) και τη μέθοδο των πολυμορφισμών μεγέθους περιοριστικών τμημάτων (Restriction Fragment Length Polymorphism) στην ανίχνευση των προαναφερθέντων γενετικών πολυμορφισμών. Διενεργήθηκε αναδρομική μελέτη σε 98 ασθενείς που πληρούσαν συγκεκριμένα κριτήρια συμμετοχής και έδωσαν έγγραφη δήλωση συγκατάθεσης. Τα αλληλόμορφα CYP2C9*2 and VKORC1 -1639G>A ανιχνεύθηκαν με PCR-RFLP (Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ακολουθούμενη από ανάλυση με τη χρήση περιοριστικής ενδονουκλεάσης), ενώ το CYP2C9*3 γονοτυπήθηκε με άμεση ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του DNA στα προϊόντα της PCR. Οι παραπάνω πολυμορφισμοί ανιχνεύθηκαν επίσης με την εφαρμογή του PGX-Thrombo StripAssay kit (ViennaLab Diagnostics,Vienna, Austria) σε 40 από τους 98 ασθενείς. Οι συχνότητες των αλληλομόρφων CYP2C9*2, CYP2C9*3 and VKORC1A βρέθηκαν 0.155, 0.075 και 0.485, αντίστοιχα. Φορεία τουλάχιστον ενός CYP2C9*3 αλληλομόρφου οδηγεί στην πιο εκσεσημασμένη μείωση της απαιτούμενης μέσης δόσης (p < 0.0001). Αντίθετα, το αλληλόμορφο CYP2C9*2 διαδραματίζει μικρότερο ρόλο (p = 0.3). Οι ασθενείς με γονότυπο VKORC1 A/A χρειάζονται περίπου το ένα τρίτο της δόσης σε σχέση με τους φυσιολογικούς ασθενείς, προκειμένου να διατηρούν το INR- στόχο εντός θεραπευτικών ορίων (p < 0.0001). Η ηλικία είναι ο μόνος δημογραφικός παράγοντας που επηρέαζει σε στατιστικά σημαντικό βαθμό τη δόση της ασενοκουμαρόλης (p < 0.0001)...