Διερεύνηση και ανάπτυξη μηχανισμών γενετικής και μεβρανικής τροποποίησης κυττάρων για χρήση σε βιοαισθητήρες

Abstract

Modern crop protection industry puts considerable efforts in the search for newpesticides (insecticides, acaricides) acting on novel biochemical and physiologicaltargets, primarily due to the seriously increasing problem of pest resistance topesticides. In this study we investigated 2 relatively new insecticide classes,neonicotinoids and tetronic acid amides in order to build a cellular biosensor for thedetection of their residues in vegetables. The study consists of 3 parts. The first part isfocused on investigating the toxicological effects of eight insecticides with differentchemical structures, three tetronic acid amides (spiromesifen, spirodiclofen,spirotetramat) and five neonicotinoids (imidacloprid, clothianidin, thiacloprid,acetamiprid, thiamethoxam) on differentiating and non- differentiating mouse N2aneuroblastoma cells. The N2a cells will be used as the biosensor’s biological part. Thecells were exposed to four different concentrations of each insecticide (3, 10, 30 and100 μΜ) for 24 and 48 hours under differentiating and non-differentiating conditions.Cytotoxicity and cell viability were estimated by the MTT, neutral red uptake (NRU)assays, propidium iodide (PI) uptake assays. Tetronic acid amides caused an increasedcytotoxicity at the two highest concentrations (30 and 100 μΜ). In addition, the axonoutgrowth impairment was measured microscopically after a coomassie brilliant bluestaining. Membrane potential and intracellular calcium concentration ([Ca2+]), weremeasured using the dye probes DiSC3(5) and Fluo-3, respectively with a fluorescenceplate reader. Βοth pesticide classes increased cellular depolarization and [Ca2+] uptakein both cell types at the two highest concentrations. Furthermore, the effects of theinsecticides on the enzymatic and biological antioxidative cell mechanisms werestudied. More specifically, Glutathione S Transferase (GST) and Superoxide dismutase (SOD) activities were measured photometrically, lipid peroxidation wasmeasured by the thiobarbituric acid assay (TBA) and the change at the levels of GSHand GSSG concentrations were measured by the Ellman method. The results showedan increase in the antioxidant enzymes specific activities as well as an increase at themalondialdehyde‘s (MDA) concentration. The insecticides also reduced GSH levels atthe highest concentrations. The same assay was used for the determination ofAcetylcholinesterase (AChE) activity. The total protein concentration was determined by the Bradford method. In addition, AChE was inserted to Vero cell membranesthrough electroinsertion and osmotic insertion. In the future, these cells will be usedas the biosensor’s biological part. Afterwards, Vero cell viability and ΑChE havebeen assessed. Osmotic insertion of AChE to Vero cells induced AChE’s activity andhad minimum effect on cell viability. In the framework of the current thesis, in the 2ndpart, an analytical method was developed for the determination of neonicotinoids andtetronic acid amides in cucumber and tomato matrices after extraction by theQuEChERS method. The results were compared afterwards with the cellularbiosensors’ results. Finally, in the 3rd part, a potentiometric method (differential pulsevoltametry) employing carbon screen printed electrodes for the determination of theinsecticides has been developed, with or without N2a- based cellular biorecognitionelements. Our results suggest that differentiated N2a cells are more sensitive topesticides than non-differentiated cells and represent a very important tool forneurobiology and neurotoxicity studies. In the near future they will play a key role inthe field of cellular biosensors of high selectivity and specificity.

Η σύγχρονη βιομηχανία φυτοπροστατευτικών προϊόντων για να καταπολεμήσει ταπροβλήματα που έχουν δημιουργηθεί από την αύξηση της ανθεκτικότητας τωνεντόμων στα φυτοπροστατευτικά προϊόντα καταβάλλει τεράστιες προσπάθειες γιατην έρευνα νέων εντομοκτόνων που στοχεύουν σε διαφορετικά βιοχημικά καιφυσιολογικά ενεργά κέντρα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν 2 σχετικά νέεςκατηγορίες εντομοκτόνων, τα νεονικοτινοειδή και τα αμίδια του τετρονικού οξέος μεαπώτερο σκοπό την ανάπτυξη κυτταρικού βιο-αισθητήρα που θα ανιχνεύει τηνύπαρξη υπολειμμάτων τους σε λαχανικά. Η παρούσα μελέτη απαρτίζεται από 3 μέρη.Στο 1ο μέρος της μελετώνται οι τοξικολογικές επιδράσεις 8 εντομοκτόνων μεδιαφορετικές χημικές δομές, 3 αμιδίων του τετρονικού οξέος (spiromesifen,spirodiclofen, spirotetramat) και 5 νεονικοτινοειδών (imidacloprid, clothianidin,thiacloprid, acetamiprid, thiamethoxam) σε διαφοροποιημένα και σε μηδιαφοροποιημένα κύτταρα νευροβλαστώματος (N2a) που θα αποτελέσουν στησυνέχεια το βιολογικό κομμάτι του κυτταρικού βιο-αισθητήρα. Τα κύτταρα κατά τηδιάρκεια της καλλιέργειας εκτέθηκαν σε τέσσερεις διαφορετικές συγκεντρώσεις τουκάθε εντομοκτόνου (3, 10, 30 και 100μΜ) για 24 και 48 ώρες σε συνθήκες πουευνοούσαν και που δεν ευνοούσαν τη διαφοροποίηση τους. Κατόπιν, για τηνεκτίμηση της κυτταροτοξικότητας/βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκανοι βιοχημικές δοκιμές πρόσληψης των χρωστικών ΜΤΤ, ουδέτερου ερυθρού (NR) καιιωδιούχου προπιδίου (PI) όπου τα αμίδια του τετρονικού οξέος προκάλεσαναυξημένη μείωση της βιωσιμότητας στις συγκεντρώσεις 30 και 100 μΜ. Παράλληλαμελετήθηκε μικροσκοπικά η παρεμπόδιση της προέκτασης των νευρικών αξόνων μεχρώση των κυττάρων με Coomassie Brilliant Blue. Ο προσδιορισμός τουμεμβρανικού δυναμικού και της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου ([Ca2+]) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των χρώσεων DiSC3(5) και Fluo-3αντίστοιχα σε φωτόμετρο φθορισμού. Τα εντομοκτόνα προκάλεσαν αποπόλωση τηςκυτταρικής μεμβράνης καθώς και αύξηση της πρόσληψης του ενδοκυτταρικού [Ca2+]κυρίως στις συγκεντρώσεις 30 και 100 μΜ και στις δυο κατηγορίες κυττάρων.Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν βιοχημικές μελέτες για την επίδραση τωνεντομοκτόνων στους ενζυμικούς και βιολογικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς τωνκυττάρων. Συγκεκριμένα μετρήθηκαν η δραστικότητα των ενζύμων S-τρανσφεράσητης γλουταθειόνης (GST), δισμουτάση του σουπεροξειδίου (SOD) με τη μέθοδο τουνιτρο-μπλε τετραζολίου (ΝΒΤ), η υπεροξέιδωση των λιπιδίων με τη μέθοδο τουθειοβαρβιτουρικού οξέος (ΤΒΑ) καθώς και η μεταβολή της συγκέντρωσης τηςανηγμένης και της οξειδωμένης γλουταθειόνης με τη μέθοδο Ellman. Παρατηρήθηκεότι τα εντομοκτόνα αύξησαν την ενεργότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων και τηςMDA μειώνοντας ταυτόχρονα τα επίπεδα της γλουταθειόνης, κυρίως στις υψηλέςσυγκεντρώσεις. Με την ίδια μέθοδο πραγματοποιήθηκε και προσδιορισμός τηςδραστικότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση (AChE) η οποία φάνηκε νααυξάνεται τόσο από την επίδραση των νεονικοτινοειδών όσο και από την επίδρασητων αμιδίων του τετρονικού οξέος. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης τωνολικών πρωτεϊνών των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Bradford. Επιπλέον,πραγματοποιήθηκε μεμβρανική τροποποίηση κυττάρων Vero με το ένζυμο AChE γιαμελλοντική χρήση τους ως βιολογικό κομμάτι του κυτταρικού βιο-αισθητήρα, μέσωτων μεθόδων της ηλεκτροπόρωσης και της οσμωτικής ένθεσης και εκτιμήθηκεκατόπιν η βιωσιμότητα των κυττάρων καθώς και η ενεργότητα του ενζύμου στακύτταρα. Παρατηρήθηκε ότι κύτταρα που τροποποιήθηκαν με τη μέθοδο της οσμωτικής ένθεσης παρουσίασαν αυξημένη βιωσιμότητα ενώ αυξήθηκε και ηδραστικότητα του ενζύμου AChE. Στο 2ο μέρος της διατριβής αναπτύχθηκε επίσης μία μέθοδος ανίχνευσης υπολειμμάτων νεονικοτινοειδών και αμιδίων του τετρονικούοξέος σε υποστρώματα αγγουριού και τομάτας μετά από εξεργασία των δειγμάτων μετη μέθοδο QuEChERS. Τα αποτελέσματα της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν στησυνέχεια για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων του κυτταρικού βιοαισθητήρα πουαναπτύχθηκε στη συνέχεια. Τέλος κατά το 3ο μέρος της διατριβής, αναπτύχθηκεμέθοδος προσδιορισμού των εντομοκτόνων σε ποτενσιοστάτη σε εκτυπωμέναηλεκτρόδια άνθρακα με τη χρήση κυττάρων N2a (κυτταρικός βιοαισθητήρας) καιχωρίς τη χρήση κυττάρων N2a με τη μέθοδο της διαφορικής παλμικής βολταμετρίας.Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τα διαφοροποιημένα κύτταρα αποτελούνένα εξαιρετικό εργαλείο μελέτης της νευροβιολογίας και της νευροτοξικότητας αφούπαρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα ευαισθησίας τους σεφυτοπροστατευτικά προϊόντα και ξενοβιοτικά και μελλοντικά αναμένεται να έχουνβασικό ρόλο στην ανάπτυξη κυτταρικών βιοαισθητήρων πολύ υψηλήςεκλεκτικότητας και ευαισθησίας.