Κυτταρογενετική και μοριακή μελέτη σε γυναίκες με το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών

Abstract

Aim: The current study examined the chromosome integrity and cytogenetic damages in females with polycystic ovary syndrome (PCOS). A possible association between chromosomal instability and clinical phenotype was also investigated. Methods: The methodology of Sister Chromatid Exchanges (SCEs), the Cytokinesis Block Micronucleus (CBMN) assay and the Fluorescence in Situ Hybridization (FISH) were applied to the cultures of peripheral blood lymphocytes in order to create a reliable cytogenetic profile of patients and healthy women. The levels of SCEs, micronuclei (MN) and the frequency of abnormal cells (expressed as binucleated cells with MN) were analyzed as quantitative indices of genotoxicity. The proliferation rate index (PRI), the nuclear division index (NDI) and the cytokinesis block proliferation index (CBPI) were analyzed as qualitative indices of cytostaticity. Additionally, the mitotic index (MI), a qualitative index of cytotoxicity was also evaluated. DNA damage was induced by the antineoplastic agents camptothecin-11 (CPT-11) (for SCEs) and mitomycin C (MMC) in MN. These agents used as a positive control. Finally, the content of MN and a possible X chromosome malsegregation were assessed in women with PCOS. Results: Females with PCOS showed increased chromosome instability expressed by enhanced genotoxicity, cytostaticity and cytotoxicity in peripheral lymphocytes. It is notable that patients with severe PCOS (HA+ANOV+PCO) demonstrated significant DNA damage than patients with two of three conditions (HA+ANOV/PCO, ANOV+PCO). Moreover, patients with anovulatory phenotype (ANOV+PCO) showed similar results with healthy subjects. Additionally, the results of FISH experiments showed that the X chromosome was not responsible for the higher rate of MN in patients, however, the proportion of aneuploid X chromosome signals was considerable. Discussion: Women with PCOS demonstrated a higher degree of genetic instability compared with healthy women and inability to promote their own cell-cycle. It was also observed a positive correlation between chromosomal instability and different phenotypes of the syndrome. The two antineoplastic agents CPT-11 and MMC have higher genotoxic effect in patients. One possible explanation about this observation could be the malfunction and consequently the inadequacy of the DNA repair mechanisms.

Σκοπός: Στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκε η χρωματοσωματική ακεραιότητα και οι επαγόμενες κυτταρογενετικές βλάβες σε γυναίκες που πάσχουν από το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών συγκριτικά με τις φυσιολογικές γυναίκες. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε περαιτέρω έλεγχος στην ομάδα των ασθενών για την εύρεση πιθανής συσχέτισης της χρωματοσωματικής ευθραυστότητας με τους διαφορετικούς τύπους των κλινικών φαινοτύπων. Μέθοδοι: Για τη δημιουργία ενός αξιόπιστου κυτταρογενετικού προφίλ χρησιμοποιήθηκαν καλλιέργειες λεμφοκυττάρων περιφερικού αίματος ασθενών και υγιών γυναικών, στις οποίες εφαρμόστηκαν οι εξής κυτταρογενετικές τεχνικές: των χρωματιδιακών ανταλλαγών (SCEs), των μικροπυρήνων (ΜΝ) μέσω της μεθόδου αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN), καθώς και του συνδυασμού της CBMN με τη μέθοδο της in situ υβριδοποίησης με φθοριοχρώματα (FISH). Πρόκειται για ευαίσθητες και αξιόπιστες τεχνικές, οι οποίες πέραν από την εκτίμησης της γενετικής βλάβης προσφέρουν και τη δυνατότητα αξιολόγησης της κινητικής του κυτταρικού κύκλου, καθώς και της επιβίωσης των κυττάρων. Έτσι μετρήθηκαν τα επίπεδα των SCEs, των ΜΝ, και των άτυπων κυττάρων (εκφρασμένα ως διπύρηνα κύτταρα με μικροπυρήνες) ως ποσοτικοί δείκτες γονοτοξικότητας, οι τιμές του δείκτη ρυθμού πολλαπλασιασμού (ΔΡΠ), του δείκτη πυρηνικής διαίρεσης (ΔΠΔ) και του παρόμοιου δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων (ΔΠΚ), ως ποιοτικοί δείκτες κυτταροστατικότητας και ο μιτωτικός δείκτης (ΜΔ), ως ποιοτικός δείκτης κυτταροτοξικότητας. Στις καλλιέργειες των λεμφοκυττάρων προστέθηκαν, ως θετικοί παράγοντες, η καμπτοθεκίνη-11 (CPT-11) και η μιτομυκίνη C (MMC) γνωστά αντινεοπλασματικά φάρμακα, τα οποία έχουν τη δυνατότητα να επάγουν τις SCEs και τους MN αντίστοιχα. Τέλος, αναλύθηκαν τα σήματα υβριδοποίησης για το Χ χρωματόσωμα στους μικροπυρήνες, για τη διερεύνηση της πιθανής εμπλοκής του στη δημιουργία των μικροπυρήνων στις ασθενείς, καθώς και στους κύριους πυρήνες για την ανίχνευση τυχόν ανευπλοειδικών φαινομένων. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα των πειραμάτων από τις μεθόδους των SCEs και της CBMN συγκλίνουν στη κοινή παρατήρηση της στατιστικώς σημαντικής αύξησης των δεικτών γονοτοξικότητας στις ασθενείς σε σύγκριση με τις φυσιολογικές γυναίκες. Οι τιμές των δεικτών κυτταροστατικότητας και κυτταροτοξικότητας βρέθηκαν σημαντικά ελαττωμένες στις γυναίκες με το σύνδρομο παρουσία ή απουσία των γονοτοξικών παραγόντων. Επιπλέον οι γυναίκες που έφεραν τη σοβαρή μορφή του συνδρόμου (υπερανδρογοναιμία/ΥΑ, ανωοθυλακιορρηξία/ΑΝΩΟΘ και πολυκυστική ωοθηκική μορφολογία/ΠΜΩ) εμφάνισαν την υψηλότερη συχνότητα χρωματοσωματικών βλαβών, ενώ οι τιμές όλων των δεικτών στις γυναίκες με τον ανωοθυλακιορρηκτικό φαινότυπο (ΑΝΩΟΘ+ΠΜΩ) φάνηκε να προσεγγίζουν αυτές των φυσιολογικών γυναικών. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων της μεθόδου FISH υποδεικνύουν την τυχαία εμπλοκή του Χ χρωματοσώματος στη δημιουργία μικροπυρήνων στις ασθενείς, ωστόσο, αυξημένα βρέθηκαν τα ποσοστά εμφάνισης ανευπλοειδικών φαινομένων με κύριο, την απώλεια του φυλετικού χρωματοσώματος. Συμπεράσματα: Τα ευρήματα της παρούσας εργασίας κατέδειξαν την ύπαρξη γενετικής αστάθειας (αυξημένες SCEs και ΜΝ, απώλεια/μη-αποχωρισμός του Χ χρωματοσώματος) στις γυναίκες με το ΣΠΩ σε σύγκριση με τις φυσιολογικές. Η αδυναμία των ασθενών να προωθήσουν τον κυτταρικό τους κύκλο είναι χαρακτηριστική. Επιπλέον διαφαίνεται η ύπαρξη συσχέτισης μεταξύ της χρωματοσωματικής αστάθειας και του κλινικού φαινοτύπου. Το γεγονός πως οι ασθενείς παρουσίασαν μία ιδιαίτερη ευαισθησία στους δύο γονοτοξικούς παράγοντες CPT-11 και MMC, που προστέθηκαν στις δύο τεχνικές, πιθανότατα υποδηλώνει διαταραχές στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του DNA των γυναικών αυτών, οι οποίες τους καθιστούν ανεπαρκείς.