Study of the role and regulation of TpL2 / COT (MAP3K8) in lung carcinogenesis: a proto-oncogene with a tumor suppressive function

Abstract

Cancer can be perceived as a disease of communication between and within cells. The aberrations are pleiotropic, but mitogen‐activated protein kinase (MAPK) pathways feature prominently. Tpl2/COT is a serine‐threonine MAPK kinase kinase (MAP3K8) at the crossroad of various signal transduction pathways that control fundamental cellular processes such as growth, proliferation, differentiation, mi‐gration and apoptosis. Despite early studies identifying Tpl2 as a proto‐oncogene activated by C‐terminal truncation in mouse and rat, a detailed evaluation of its expression and function in human malignancy is missing and the physiological role of Tpl2/COT in carcinogenesis remains enigmatic.One of the three major human tissues where Tpl2 is expressed at highest levels is the lung. Lung cancer is the leading cause of cancer related death worldwide, re‐flecting the need for a better understanding of the mechanisms that underlie the development of pulmonary carcinomas. The Ph.D. thesis presented here focuses on the characterization of the role and of the mechanisms regulating the expres‐sion of Tpl2/COT1 in lung tumor cells during the onset of lung cancer development and through its progression.In this regard, we were able to reveal an unprecedented role for Tpl2/COT as sup‐pressor of lung carcinogenesis. This conclusion was based on a number of novel findings obtained through the extensive analysis of human tissue and of ex vivo and in vivo experimental models. We showed that COT expression is significantly reduced in human lung cancer compared to normal lung tissue providing the first demonstration that COT can be differentially expressed in a human malignancy. Importantly, the downregulation of COT is found to be of clinical relevance as it correlates with a more aggressive tumor phenotype and with poor prognosis in pa‐tients with lung cancer.Our data disclose 3 mechanisms responsible for COT downregulation in primary human lung tumors: (i) allelic imbalance at the COT locus; (ii) global DNA hypomethylation‐associated upregulation of miR‐370 which targets COT transcripts and (iii) activated Ras signaling affecting both COT transcription and protein stability. The operation of multiple genetic and epigenetic aberrations leading to loss of wild‐type COT in primary lung tumors underlines a previously unappreciat‐ed broader role for this pathway in lung carcinogenesis. This is corroborated by our experimental data showing that ablation of the Tpl2 gene in mice dramatically ac‐celerates the onset and multiplicity of urethane‐induced lung tumorigenesis.Additionally, we provide mechanistic evidence to suggest that Tpl2/COT antago‐nizes oncogene‐induced cell transformation and survival through a pathway involv‐ing the tumor suppressor p53 downstream of JNK. In particular, our studies define Tpl2/COT as a novel physiological antagonist of oncogenic Ras, thus also expanding our understanding of signaling and function of this major human oncogene. An im‐portant functional interaction between Tpl2/COT, JNK and p53 which controls apoptosis is revealed, providing a telling example of how tumor cells usurp alter‐native pathways that lower intrinsic barriers to malignant transformation.

Ο καρκίνος μπορεί να θεωρηθεί ως ασθένεια στην επικοινωνία μεταξύ και στο εσωτερικό των κυττάρων. Οι δυσλειτουργίες που προκύπτουν είναι πλειοτροπι‐κές, αλλά τα μονοπάτια των κινασών που ενεργοποιούνται από μιττογόνα (Mito‐gen Activated Protein Kinases) φαίνεται να παίζουν εξέχοντα ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Η Tpl2 είναι μία ΜΑΡ3 κινάση σερίνης/θρεονίνης στο σταυ‐ροδρόμι πολλών και διαφορετικών μονοπατιών σηματοδότησης που ελέγχουν πρωτεύουσας σημασίας κυτταρικές διεργασίες, όπως η κυτταρική αύξηση, πολ‐λαπλασιασμός διαφοροποίηση, μετανάστευση και απόπτωση. Παρά τις αρχικές που οδήγησαν στην ταυτοποίηση της Tpl2 ως πρωτο‐ογκογονίδιο που ενεργοποι‐είται μετά από καρβοξυτελική αποκοπή σε ποντικούς και αρουραίους, μία λεπτο‐μερής εκτίμηση της έκφρασης και της λειτουργίας της Tpl2/COT στην ανθρώπινη κακοήθεια λείπει ακόμη από τη βιβλιογραφεία. Ο φυσιολογικός ρόλος της Tpl2 στην καρκινογένεση παραμένει αινιγματικός.Ένα από τα 3 κυριότερα όργανα όπου εμφανίζονται από τα υψηλότερα επίπεδα της COT είναι οι πνεύμονες. Ο καρκίνος των πνευμόνων είναι η σημαντικότερη αιτία θανάτου καρκινοπαθών παγκοσμίως, αντανακλώντας την άμεση ανάγκη για καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη καρκινωμάτων του αναπνευστικού. Η διδακτορική διατριβή που παρουσιάζεται εδώ εστιάζει στον χαρακτηρισμό του ρόλου και των μηχανισμών που ελέγχουν την έκφραση της Tpl2/COT στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα, κατά την έναρξη της ανάπτυ‐ξης του καρκίνου του πνεύμονα καθώς και κατά τη διάρκεια εξέλιξής του.Ερευνώντας υπό αυτό το πρίσμα, καταφέραμε να αποκαλύψουμε έναν απροσδό‐κητο ρόλο για την Tpl2/CΟT ως καταστολέα της καρκινογένεσης του πνεύμονα . Αυτό το συμπέρασμα βασίστηκε σε έναν αριθμό νέων ευρημάτων στα οποία κα‐ταλήξαμε μετά από ενδελεχή ανάλυση ανθρώπινου ιστού και χρήση πειραματό‐ζωων και ex vivo μοντέλων. Δείξαμε πως η έκφραση της COT είναι σημαντικά μειωμένη στον καρκίνο του πνεύμονα στον άνθρωπο συγκριτικά με τον φυσιολο‐γικό ιστό, παρέχοντας έτσι την πρώτη απόδειξη πως η COT μπορεί να παρουσιά‐σει διαφορική έκφραση σε μία ανθρώπινη κακοήθεια. Ανάλογα σημαντικό ήταν το εύρημα πως η μείωση της COT έχει κλινική προέκταση καθώς συσχετίζεται με πιο επιθετικό φαινότυπο του όγκου και κακή πρόγνωση στους ασθενείς με καρκί‐νο του πνεύμονα.Τα δεδομένα μας περικλείουν 3 μηχανισμούς υπεύθυνους για τη μείωση της έκ‐φρασης της COT σε πρωτεύοντες όγκους του πνεύμονα στον άνθρωπο: (i) αλληλι‐κή αστάθεια στον γενετικό τόπο της COT (ii) υπερέκφραση του mir370 που στο‐χεύει τα μετάγραφα της COT μετά από υπομεθυλίωση του γενετικού του τόπου, στα πλαίσια της γενικής υπομεθυλίωσης που συμβαίνει κατά την καρκινογένεση (iii) ενεργοποίηση σηματοδότησης Ras που επηρεάζει και την μεταγραφή και την πρωτεϊνική σταθερότητα της Tpl2/COT.Η ύπαρξη πολλαπλών γενετικών και επιγενετικών ανωμαλιών που οδηγούν σε απώλεια ή σημαντική μείωση της αγρίου τύπου Tpl2 / COT σε πρωτεύοντες όγκο‐υς στον πνεύμονα υπογραμμίζει έναν έως τώρα μη εκτιμημένο, ευρείας σημαντι‐κότητας ρόλο αυτού του μονοπατιού στην καρκινογένεση του πνεύμονα. Αυτό ενισχύεται και επιβεβαιώνεται και από τα πειραματικά μας δεδομένα που δείχ‐νουν πως η έλλειψη του γονιδίου στα πειραματόζωα επιταχύνει δραματικά την έναρξη και την πολλαπλότητα της ογκογένεσης στον πνεύμονα μετά από χορήγη‐ση ουρεθάνης.Επιπρόσθετα, παρουσιάζουμε μηχανιστικές ενδείξεις που υποδεικνύουν πως η Tpl2/COT ανταγωνίζεται τον επαγόμενο από ογκογονίδια κυτταρικό μετασχημα‐τισμό και επιβίωση, μέσω ενός μονοπατιού που περιλαμβάνει την ογκο‐κατασταλτική p53 καθοδικά της JNK. Πιο συγκεκριμένα, οι μελέτες ορίζουν την Tpl2/COT ως ένα νέο φυσικό ανταγωνιστή της ογκογόνου Ras, διευρύνοντας α‐κόμη περισσότερο την κατανόηση της λειτουργίας και της σηματοδότησης ενός τόσο σημαντικού ανθρώπινου ογκογονιδίου. Μία ενδιαφέρουσα λειτουργική αλ‐ληλεπίδραση μεταξύ των Tpl2/COT, JNK και p53 που ελέγχει την απόπτωση απο‐καλύπτεται, παρέχοντας ταυτόχρονα ένα ενδεικτικό παράδειγμα για το πώς τα καρκινικά κύτταρα εκμεταλλεύονται και καθοδηγούν εναλλακτικά μονοπάτια για να μειώσουν τους έμφυτους φραγμούς στον καρκινικό μετασχηματισμό.