Expression of programmed death-1 (PD-1) and PD-1 ligands in rheumatoid arthritis, in human and murine tissue, and their role in immunological tolerance

Abstract

The immune system has evolved to protect the body from foreign invading pathogens. To accomplish thiscritical role, T lymphocytes must discriminate between self and non-self. Among the mechanisms involved insafeguarding of self-tolerance, B7/CD28 membrane receptors are crucial for fine-tuning of T cell function.Programmed death-1 (PD-1) is an inhibitory lymphocyte receptor that has recently emerged as a key playerin induction and maintenance of tolerance.Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease of joints and extra-articular tissues, whichcauses severe disability and premature mortality [1, 2]. Numerous data support a central role of T cells inRA with these cells thought to be triggered locally in an antigen-specific manner resulting in breakdown oftolerance, synovial inflammation, and autoantibody production [3-7]. In the collagen-induced arthritis (CIAanimal model of RA, type II collagen (CII)– reactive CD4+ T cells are primary mediators of diseaseinduction driving autoantibody production by B cells and localized chronic inflammatory response [8-12].Although the role of co-stimulation is well documented in RA and has been further supported by the efficacyof CTLA4-Ig in severe RA, the role of this family of molecules has not been explored in a systematic,organized fashion. We sought to determine the role of PD-1/PD-1 ligands (PD-1L) in RA and test thehypothesis whether defective expression and/or function of this pathway may contribute to T cellhyperactivity within the inflamed joint.Genomic DNA was extracted from peripheral whole blood obtained from patients and healthy blood donors.Genotyping for the PD1.3A was performed by polymerase chain reaction (PCR). PD-1/PD-1L expression wasexamined on synovial tissue and synovial fluid (SF) mononuclear cells from RA patients byimmunohistochemistry and flow cytometry. PD-1 function was assessed in T cells stimulated with anti-CD3and PD-L1.Fc to crosslink PD-1. Collagen-induced arthritis (CIA) was induced in PD-1-/- C57Bl/6 mice andrecombinant PD-L1.Fc was injected to activate PD-1 in vivo.A. Human studiesTo determine whether PD-1 SNPs are associated with susceptibility to RA in our cohort, we analyzed thegenomic DNA of 86 RA patients and 227 age- and sex- matched healthy controls for the PD1.3 SNP. Nosubstantial difference in frequencies of PD1.3 heterozygosity (G/A) between RA patients and healthycontrols (15,1% versus 19,4%, p>0,05) was found.We have shown that RA synovium and SF were enriched in PD-1+ T cells (24 ± 5% vs. 2 ± 1% inosteoarthritis, p<0.01) and PD-1L+ monocytes/macrophages. And that PD-1 crosslinking inhibited T cell proliferation and IFN-γ production in RA patients. Howewver, despite high expression within the joint, PB Tcells incubated with RA SF and SF T cells from active RA exhibited reduced PD-1–mediated inhibition atsuboptimal –but not optimal– PD-L1.Fc concentrations, indicating a probable diminishing effect of theinflammatory microenvironment of RA on pathway’s function.B. Animal studiesPD-1-/- mice demonstrated increased incidence (73% vs. 36% in wild-type mice, p<0.05) and severity(mean maximum arthritis score 4.8 vs. 2.5, p=0.001) of CIA, associated with enhanced T cell proliferationand cytokine (IFN-γ, IL-17) production in response to type II collagen. Most interestingly, PD-L1.Fctreatment ameliorated CIA (mean maximum arthritis score 1.8 ± 0.6 vs. 2.5 ± 0.7) and reduced anticollagenII T cell responses (induction in proliferation [9cpm] 9594 ± 2147 vs. 4712 ± 2256).Taken together, our data suggest that τhe negative costimulatory PD-1/PD-1L pathway regulates peripheralT cell responses in both human and murine RA. The PD-1/PD-1L in rheumatoid synovium may represent anadditional target for immunomodulatory therapy in RA.

Τα αυτοάνοσα νοσήματα προκαλούνται ως συνέπεια διαταραχών της ανοσολογικής ανοχής του οργανισμούέναντι αυτοαντιγόνων. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στηνπεριφέρεια έχει η οικογένεια των Β7/CD28 μεμβρανικών υποδοχέων. Οι υποδοχείς αυτοί ενεργοποιούνταιμετά από πρόσδεση ειδικών συνδετικών μορίων και διαβιβάζουν σήματα ενεργοποίησης ή καταστολής των Τλεμφοκυττάρων. Η ισορροπία μεταξύ «θετικών» και «αρνητικών» σημάτων ενεργοποίησης καθορίζει τελικάτη δραστικότητα των λεμφοκυττάρων και προστατεύει από την ανάπτυξη αυτοανοσίας. Ο υποδοχέας PD-1επάγεται στην κυτταρική επιφάνεια ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμόκαι την έκκριση φλεγμονωδών κυτταροκινών. Η ενεργοποίηση του PD-1 πραγματοποιείται μέσω ειδικώνσυνδετών (PD-1 ligand 1 [PD-L1], PD-L2) που εκφράζονται κυρίως σε αντιγονο-παρουσιαστικά κύτταρα.Πειράματα σε ζωικά πρότυπα έχουν αναδείξει το σημαντικό ρόλο του PD-1 στη ρύθμιση τηςαυτοδραστικότητας και στην ανάπτυξη αυτοανοσίας.Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) αποτελεί την πρότυπη φλεγμονώδη αυτοάνοση αρθρίτιδα στον άνθρωπο καιχαρακτηρίζεται από χρόνια συστηματική φλεγμονή και καταστροφή διαφόρων ιστών. Τα παθογενετικάχαρακτηριστικά της ΡΑ είναι η παρουσία αυτοδραστικών Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια και τουςπροσβεβλημένους ιστούς, η υπερπαραγωγή αυτοαντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα και οι αυξημένεςσυγκεντρώσεις φλεγμονωδών κυτταροκινών.Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος του PD-1 και των συνδετών του στηρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων που συμμετέχουν στην παθογένεια της αρθρικής βλάβης της ρευματοειδούςαρθρίτιδας.Α. Μελέτες σε ανθρώπους:Εξετάστηκαν 86 ασθενείς με ΡΑ και 227 υγιείς εθελοντές για την παρουσία του PD1.3 μονονουκλεοτιδικούπολυμορφισμού με τεχνική PCR και χρήση ειδικής νουκλεάσης περιορισμού (PCR-based restriction fragmentlength polymorphism analysis). 9ε διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα τουπολυμορφισμού μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων (15,1% vs 19,4%, p>0,05).Για να διερευνήσουμε τη συμμετοχή του PD-1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στο σημείο τηςφλεγμονής, μελετήσαμε με ανοσοϊστοχημεία την έκφραση του PD-1/PD-L1 σε βιοψίες αρθρικού υμένα απόυγιείς, ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) και ΡΑ. 9ιαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση του PD-1, κυρίως από ΤCD3+ κύτταρα, σε 8 από τα 9 (89%) δείγματα αρθρικού υμένα ΡΑ, σε σχέση με 2 από τα 8 (25%) καικανένα από τα 9 (0%) δείγματα ΟΑ και υγιούς αρθρικού υμένα αντίστοιχα. Έκφραση του PD-L1, κυρίως απόμακροφάγα, ανιχνεύθηκε στις βιοψίες από ΡΑ και ΟΑ ενώ στα δείγματα υγιούς ιστού η έκφρασή του ήταν μηδαμινή. Επιπλέον, ο βαθμός της έκφρασης των PD-1/PD-L1 ήταν ανάλογος του βαθμού της φλεγμονής.Τα ανωτέρω υποδεικνύουν πιθανή συμμετοχή του PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των φλεγμονωδών Τκυτταρικών αποκρίσεων σε ιστικό επίπεδο. Στη συνέχεια, μονοπύρηνα κύτταρα αρθρικού υγρού (SFMCs)απομονώθηκαν από ασθενείς με ΡΑ και ΟΑ και μελετήθηκε η έκφραση των PD-1 και PD-L1 στα CD4+κύτταρα με κυτταρομετρία ροής. Σε αντιστοιχία με τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας, βρέθηκεαυξημένη έκφραση του PD-1 στα Τ κύτταρα ΡΑ (24 ± 5% vs. 4 ± 1%, p=0.003), ιδιαίτερα στουςενεργοποιημένους υποπληθυσμούς (CD69+, CD25+).Παρά την έκφραση του PD-1 στο περιφερικό αίμα και τους προσβεβλημένους ιστούς (αρθρικός υμένας) τωνασθενών με ΡΑ, η λειτουργία του ανοσορρυθμιστικού συστήματος PD-1/PD-L1 ενδεχομένως νατροποποιείται στο φλεγμονώδες περιβάλλον της άρθρωσης. Το ενδεχόμενο αυτό εξετάστηκε κατ’αρχήν, μεκαλλιέργειες από SFMCs κύτταρα από ΡΑ και ΟΑ, όπου μελετήθηκε η ικανότητα των κυττάρων αυτών ναεπάγουν την έκφραση του PD-1 μετά από ενεργοποίησή τους με PMA και ionomycin. Βρέθηκε ότι στην ΡΑ ηικανότητα αυτή ήταν μειωμένη (επαγωγή του PD-1 από 18 ± 5% σε 29 ± 4% στην ΡΑ και από 5 ± 2% σε25 ± 4% στην ΟΑ). Στη συνέχεια, CFSE-σημασμένα CD4+ T λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος,καλλιεργήθηκαν απουσία ή παρουσία 15% εκχυλίσματος αρθρικού υγρού από ΡΑ. Μετά από ενεργοποίησημε την πρωτεΐνη PD-L1.Fc, διαπιστώθηκε ότι, παρουσία ορού από ΡΑ, η ικανότητα του PD-1 να αναστέλλειτον Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό ήταν μειωμένη (αδιαίρετα T κύτταρα την ημέρα 5: 65.1 ± 4.7% vs. 81.2± 7.8%, p=0.028).Επιπρόσθετα, για να μελετηθεί η ικανότητα του PD-1 να ρυθμίζει την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων πουβρίσκονται στο αρθρικό υγρό της ΡΑ, πραγματοποιήθηκαν κυτταροκαλλιέργειες CD4+ T κυττάρωνπεριφερικού αίματος και αρθρικού υγρού από ασθενείς με ΡΑ (paired samples), όπου χορηγήθηκαν διάφορεςσυγκεντρώσεις PD-L1.Fc ώστε να ενεργοποιηθεί ο υποδοχέας PD-1. Η ικανότητα του PD-1 να περιορίσει τονπολ/σμό και την παραγωγή IFN-γ από CD4+ Τ κύτταρα της ρευματοειδούς άρθρωσεηςήταν μειωμένη σεσχέση με τα κύτταρα του περιφερικού αίματος, ιδιαίτερα σε χαμηλές συγκεντρώσεις PD-L1.Fc (αναστολήπολ/μού 31 ± 9% vs 53 ± 8% p=0.003).Β. Μελέτες σε ζώα:Ποντίκια που δεν εκφράζουν PD-1 (PD-1-/-) δημιουργήθηκαν με διαγραφή του διαμεμβρανικού καιενδοκυττάριου τμήματος του γονιδίου του PD-1. Η αρθρίτιδα επαγόμενη από κολλαγόνο (collagen-inducedarthritis, CIA) σε ποντικούς αποτελεί ένα κλασσικό και καλά μελετημένο πειραματικό πρότυπο αυτοανοσίαςπροσομοιάζον στην ανθρώπινη ρευματοειδή αρθρίτιδα.Η έλλειψη του PD-1 θα μπορούσε να προκαλέσει υπέρμετρη ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και επομένωςαύξηση της έντασης και του ποσοστού της αρθρίτιδας. Για να εξετάσουμε αυτή την υπόθεση, προκλήθηκε CIA σε ποντίκια Β6-PD-1-/- με χορήγηση κολλαγόνου τύπου ΙΙ (CII). Παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένοποσοστό και ένταση αρθρίτιδας, που εκτιμήθηκε μακροσκοπικά και ιστολογικά, σε σχέση με τα wild type B6ποντίκια (mean ± SEM of maximum arthritis score, Β6-PD-1-/- : 5.0 ±1.2, n=16, vs Β6 wt: 2.3 ±1.2, n=14,p=0.040).Η ενεργοποίηση του συστήματος PD-1/PD-L1, θα μπορούσε να προκαλέσει την αναστολή της διέγερσης τωνΤ λεμφοκυττάρων και επομένως να περιορίσει τον βαθμό της επαγόμενης αρθρίτιδας. Σε Β6 ποντίκια, στοπειραματικό πρότυπο της CIA, χορηγήθηκε η συνθετική πρωτεΐνη PD-L1.Fc (που αποτελείται από τοεξωκυττάριο τμήμα του PD-L1 και το Fc τμήμα της IgG2a ανοσοσφαιρίνης) που ενεργοποιεί το PD-1 in vivo,στο στάδιο πρόκλησης της αρθρίτιδας (πρώτες 10 ημέρες). Στα ποντίκια αυτά παρατηρήθηκε ηπιότερηαρθρίτιδα (μέση ένταση αρθρίτιδας: 1.8 ± 0.6) σε σχέση με τους μάρτυρες, που δεν έλαβαν τη θεραπεία(2.5 ± 0.7) (n=5 σε κάθε ομάδα).Συμπερασματικά, τα ευρήματα της μελέτης αυτής υποστηρίζουν ένα σημαντικό ρόλο του ανασταλτικούσυστήματος PD-1/PD-L1 στη ρύθμιση των Τ λεμφοκυττάρων στη ΡΑ. Τεκμηριώνεται διαταραχή τηςέκφρασης και λειτουργίας του PD-1 ως συνέπεια του φλεγμονώδους περιβάλλοντος της ΡΑ. Η έκφραση τουPD-1/PD-L1 στον αρθρικό υμένα της ΡΑ και η έντονη επίδρασή του στην ανάπτυξη αρθρίτιδας σεπειραματικά ζωικά πρότυπα, υποδεικνύουν συμμετοχή του ανοσορρυθμιστικού αυτού συστήματος στην Τανοσολογική ανοχή, με δυνατότητα παρέμβασης για θεραπευτικούς σκοπούς.