Μέθοδοι ενίσχυσης της κυτταροτοξικής ικανότητας λεμφοκυττάρων έναντι καρκινικών κυττάρων-στόχων

Abstract

Ηuman peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated in vitro, for 3 days with anti-CD3 monoclonal antibody produce and secrete in their culture supernatant agents, which specifically stimulate lymphocyte subpopulations of the innate immune system. This soluble mediator-rich culture supernatant, termed ACD3S, contributes to the enhancement of cytotoxicity of allogeneic normal donor- and cancer patient-derived lymphocytes, upon short-term (3 hours) incubation and induces the expansion of NK-T cells. Indeed, when highly purified PBMC subpopulations were incubated with ACD3S and subsequently assayed in standard cytotoxicity assays, ACD3S effect was found to be mainly exerted via NK cell lysis induction, whereas CD8+ and CD3+CD56+ cells marginally contributed to the observed enhancement of cytotoxicity. To investigate the mechanisms underlying its biological function and identify novel soluble molecules responsible for the supernatant’s effect, ACD3S was subjected to proteomic analysis. Normal donor-derived PBMC from several individuals were cultured in protein-free hybridoma medium (PFHM), in the presence (ACD3S) or absence (ACS; control supernatant) of anti-CD3. Highly active ACD3S and the respective ACS samples were concentrated (x100), separated by 2-D gel electrophoresis and proteins were visualized by silver staining. The most abundant protein spots were selected from the complex ACD3S electrophoretic profile, trypsinized and their peptide fingerprints analyzed using nano-HPLC serially connected to ES-MS. Each spectrum was compared for similarity matches in up-dated on-line databases. The proteins identified, were classified into three main categories: (a) cytokines with immunoregulatory properties (GM-CSF, IL-2, IL-4, IFN-γ); (b) membrane-bound molecules, potentially present in soluble form (T-cell receptor alpha chain, annexin I); and (c) a variety of agents (IGF-1, LEG7, Ttd1), whose potential involvement in inducing target lysis needs further investigation. We report herein, that IGF-1 significantly increases PBMC cytotoxicity against various targets, including autologous tumor cells isolated from cancer patients, however, in all concentrations assayed, ACD3S effect was proven superior. An alternative approach for identifying and quantifying specific immunomodulators present within ACD3S was performed using protein multiplex microarrays. This method confirmed the presence of specific cytokines, as well as of several chemokines, whose amounts in principle decreased following prolonged T cell stimulation with anti-CD3. To investigate the potential immunotherapeutic ability of ACD3S-stimulated NK cells to eliminate tumor cell progression, we performed in vivo studies, using as effector cells the human NK cell line NK-92. The tumor model consisted of the subcutaneous inoculation of the human breast cancer cell line MCF-7 into SCID mice, which are immunodeficient and therefore do not reject human cells. ACD3S-treated NK-92 cells and NK-92 cells treated with IL-2 (used as for a negative control) were similarly injected into the same mice at weekly intervals after tumor cell inoculation and for a total period of two subsequent weeks. Mice treated with ACD3S-stimulated NK-92 cells exhibited delayed in the development of the MCF-7 tumors and showed a prolongation in their overall survival compared to mice of the control groups. We conclude that the cytokine-rich supernatant ACD3S exerts a variety of biological functions both, in vitro or in vivo and can eventually be applied in ex vivo immunotherapeutic protocols aiming at tumor regression.

Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα ενεργοποιημένα in vitro με αντι-CD3 εκκρίνουν στο υπερκείμενο της καλλιέργειας παράγοντες που ενεργοποιούν λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς της μη ειδικής ανοσίας. Το πλούσιο σε ανοσοτροποποιητικούς παράγοντες υπερκείμενο, το ACD3S, επάγει την κυτταροτοξικότητα ετερόλογων λεμφοκυττάρων προερχόμενων από υγιείς δότες και ασθενείς, μετά από σύντομη επώασή τους (3 ώρες) και προάγει τον πολλαπλασιασμό των ΝΚΤ (CD3+CD56+) λεμφοκυττάρων. Όταν απομονωμένοι υποπληθυσμοί λεμφοκυττάρων (CD3+, CD4+, CD8+ T κυττάρων και CD19+ Β κυττάρων) επωάστηκαν με το ACD3S, διαπιστώθηκε ότι ο κυτταρικός υποπληθυσμός που επηρεάζεται άμεσα από το ACD3S είναι τα ΝΚ κύτταρα. Για τη διερεύνηση των υπεύθυνων μηχανισμών για την λειτουργική δράση του ACD3S και τον προσδιορισμό των υπεύθυνων μορίων για τη του βιολογική δράση χρησιμοποιήθηκε κυρίως η μέθοδος της προτεομικής ανάλυσης (proteomics). Λεμφοκύτταρα φυσιολογικών δοτών καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό χωρίς ορό (PFHM) με (ACD3S) και χωρίς (ΑCS) αντι-CD3. Τα δείγματα ACD3S με την μεγαλύτερη ενεργότητα (1lt) και τα αντίστοιχα ACS συμπυκνώθηκαν (x100) και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων. Τα πηκτώματα εμφανίστηκαν με χρώση νιτρικού αργύρου. Το ACD3S εμφάνισε ένα πλούσιο ηλεκτροφορητικό πρότυπο σε αντίθεση με το υπερκείμενο ελέγχου, ACS και το PFHM. Τα πρωτεϊνικά σημεία με την εντονότερη χρώση από το πλούσιο σε πρωτεΐνες ACD3S πρότυπο, τρυψινοποιήθηκαν και το πεπτιδικό τους αποτύπωμα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας nano-HPLC συνδεδεμένο με ES-MS. Κάθε πεπτιδικό αποτύπωμα διερευνήθηκε έναντι γνωστών βάσεων δεδομένων. Ταυτοποιήθηκε σειρά πρωτεϊνών, που διαχωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: (α) κυτταροκίνες με ανοσορυθμιστικά χαρακτηριστικά (GM-CSF, IL-2, IL-4, ΙFN-γ), (β) μεμβρανικές πρωτεΐνες που πιθανόν υπάρχουν σε διαλυτή μορφή (α-αλυσίδα του TCR, αννεξίνη Ι) και (γ) διάφορες πρωτεΐνες (IGFI, LEG7), των οποίων η συμμετοχή στην κυτταροτοξικότητα μελετάται. Διαπιστώθηκε η ικανότητα του IGF-I να επάγει έστω και σε μειωμένο βαθμό σε σχέση με το ACD3S κυτταροτοξικότητα ετερόλογων PBMC έναντι καρκινικών κυττάρων-στόχων. Έγινε τιτλοδότηση της βέλτιστης συγκέντρωσης του IGF-I αλλά και του χρόνου επώασής του τόσο με PBMC όσο και με της σειράς ανθρώπινων ΝΚ κυττάρων, ΝΚ-92 στα οποία διαπιστώθηκε αντίστοιχη δράση. Μια εναλλακτική προσέγγιση για τον προσδιορισμό και ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων ανοσοτροποποιητικών παραγόντων στο ACD3S πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο των πρωτεϊνικών συστοιχιών (DiscoverLightTM Pierce). Επιβεβαιώθηκε η παρουσία συγκεκριμένων κυτταροκινών, αλλά και χημειοκινών, των οποίων οι συγκεντρώσεις μειώνονταν μετά από παρατεταμένη ενεργοποίηση με το anti-CD3. Για τη διερεύνηση πιθανής ανοσοθεραπευτικής ικανότητας των ενεργοποιημένων από το ACD3S ΝΚ κυττάρων που θα έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, πραγματοποιήθηκαν in vivo μελέτες. Το πειραματικό μοντέλο όγκου που χρησιμοποιήθηκε σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια SCID, περιλάμβανε τη χρήση της καρκινικής σειράς του μαστού MCF-7. Κύτταρα ΝΚ-92 ενεργοποιημένα με ACD3S και τα οποία εμφάνισαν in vitro αυξημένη ικανότητα λύσης των MCF-7 καρκινικών κυττάρων, χορηγήθηκαν προστατευτικά και θεραπευτικά σε ποντίκια με αποτέλεσμα τη βελτίωση της επιβιωσιμότητας των ζώων ενώ σημαντικό ποσοστό ζώων παρέτεινε το χρονικό διάστημα εμφάνισης του όγκου σε σχέση με τα ζώα της ομάδας των μαρτύρων.