Μελέτη παραγόντων που επηρεάζουν τη συγκέντρωση ελευρωπαΐνης σε ιστούς και όργανα της ελιάς (Olea europaea L.)

Abstract

In the present dissertation, the effect of various factors on oleuropein concentration in different tissues or organs of the olive tree (Olea europaea L.) was studied. These factors were two abiotic stress conditions (salinity and water stress), fruit growth and ripening, two training systems, leaf canopy position and the genotype (cultivar). The aim of the first experiment was to determine the phenolic status (total phenol content, oleuropein and hydroxytyrosol) and antioxidant activity of four olive cultivars under saline conditions in two different plant parts (leaves and root). We also tested the possible relationship between oleuropein and glucose, since the latter compound is a part of the former molecule and accumulates under saline conditions. The data indicate that salinity stimulated the biosynthesis of phenols and oleuropein, especially in leaves, whereas the hydroxytyrosol concentration was either negatively or not affected by the salt stress. Oleuropein was the main phenolic compound in both tissues regardless of NaCl treatments. In leaves, glucose showed a totally inverse response to salinity than that of oleuropein, while a highly negative correlation existed between these two substances (R = -0.90, -0.80, -0.88 and -0.84 for ‘Zard’, ‘Ascolana’, ‘Koroneiki’ and ‘Arbequina’, respectively). A possible explanation for this relationship is that oleuropein acts as a glucose-reservoir for osmoregulation or high energy-consuming processes required for plant adaptation to salinity. A highly significant correlation was recorded between total phenol content and antioxidant activity in both leaves and roots. Finally, there is no indication pointing to translocation of phenolic compounds between leaves and root owing to exposure to salt stress. The olive tree (Olea europaea L.) is often exposed to severe water stress during the summer season. So, in the second experiment, we determined the changes in total phenol content, oleuropein and hydroxytyrosol of four olive cultivars (‘Gaidourelia’, ‘Kalamon’, ‘Koroneiki’ and ‘Megaritiki’) grown under water deficit conditions for two months. Furthermore, we investigated the photosynthetic performance in terms of gas exchange and chlorophyll a fluorescence, as well as malondialdehyde content and antioxidant activity. Net CO2 assimilation rate, stomatal conductance and Fv/Fm ratio decreased only in severe water deficit (SWD). Photosynthetic rate was reduced mainly due to stomatal closure, but damage to PSII also contributed to this decrease. Water stress induced the accumulation of phenolic compounds, especially oleuropein, suggesting their role as antioxidants. Total phenol content increased in SWD treatment and oleuropein presented a slight increase in moderate water deficit (MWD) and a sharper one in SD treatment. Hydroxytyrosol showed a gradual decrease as water stress progressed. Malondialdehyde (MDA) content increased due to water stress, mostly after 60 days, while antioxidant activity increased for all cultivars in the SWD treatment. ‘Gaidourelia’ could be considered as the most tolerant among the tested cultivars, showing higher phenolic concentration and antioxidant activity and lower lipid peroxidation and photochemical damage. The results indicated that water stress affected olive tree physiological and biochemical parameters and the magnitude of this effect depended on genotype, the degree of water limitation and duration of treatment. However, the severity and the duration of water stress might exceed antioxidant capacity, since MDA levels and subsequent oxidative damage increased after two months of water deficit. Fruit growth is a complex and long lasting process, during which several metabolic changes become prominent. The aim of the third study was to determine the changes in phenolic compounds, ascorbic acid and antioxidant activity of six olive cultivars during fruit development. The data indicated that total phenol content, oleuropein, ascorbic acid and antioxidant activity were high during fruit setting and pit hardening and decreased as maturation period progressed. However, the extent of the reduction varied, depending on the studied parameter. On the other hand, hydroxytyrosol and tyrosol slightly increased as maturation period progressed. For all cultivars, a significantly negative correlation was evident between oleuropein and olive fruit growth (R = -0.92, -0.93, -0.80, -0.88, -0.85 and -0.85 for ‘Barnea’, ‘Chondrolia Chalkidikis’, ‘Gaidourelia’, ‘Kalamon’, ‘Koroneiki’ and ‘Sevillano’, respectively), suggesting a close relationship between them. Furthermore, comparing the oleuropein concentration with the precocity of ripening for each cultivar, it appears that the precocious cultivars ‘Sevillano’ and ‘Chondrolia Chalkidikis’ had slightly lower oleuropein concentration than the mid or late ripening cultivars ‘Gaidourelia’, ‘Barnea’, ‘Kalamon’ and ‘Koroneiki’. The decrease in total phenol content was also related to the agronomical characteristics of the olive fruit, considering the ripening season of each cultivar. Finally, ascorbic acid concentration was mainly high at the initial maturity stages, regardless of the cultivar. In the fourth experiment, two training systems and leaf canopy position were tested, in order to determine their effect on the main phenolic content of two Greek olive cultivars, namely ‘Chondrolia Chalkidikis’ and ‘Kalamon’. The fifteen-year-old olive trees were grown in the experimental farm of the Aristotle University of Thessaloniki, Greece and were trained either in vasebush or in globe system. Current season leaves were sampled from the periphery and the inner part of the olive tree canopy and light intensity was measured with a portable light meter. Total phenol and oleuropein concentrations were determined. The results indicated that both cultivars presented higher total phenol content (TPC) in the vasebush shape trees than in the globe ones. In ‘Kalamon’ the mean values of TPC was 42.10 and 34.79 mg g-1 f.w. for the vasebush and globe shaped trees, respectively, while, in ‘Chondrolia Chalkidikis’ it was 36.24 and 25.86 mg g-1 f.w., respectively. Concerning leaf position, the olive cultivars had higher TPC in the periphery than in the inner part of the canopy, except for the globe trees of ‘Kalamon’, where no significant differences were recorded between the two positions. Training system also affected oleuropein concentration. For both cultivars the vasebush shaped trees had higher oleuropein concentration than the globe ones, namely 32.04 and 16.18 mg g-1f.w. for the vasebush and globe trees of ‘Kalamon’, respectively, and 30.26 and 11.73 mg g-1 f.w. for ‘Chondrolia Chalkidikis’. In addition, oleuropein concentration was affected for both cultivars by leaf canopy position, being higher in the periphery of the canopy in both training systems, except for the vasebush shaped trees of ‘Kalamon’, where no differences were recorded. The chemical and biochemical composition of olives relies on some agronomical factors, one of which is the cultivar. In the fifth study, fruits and leaves of 15 Greek olive cultivars (‘Asprolia Leukokarpos’, ‘Galatista’, ‘Kalamon’, ‘Kothreiki’, ‘Maronia’, ‘Mastoidis’, ‘Mavrolia Messinias’, ‘Megaritiki’, ‘Petrolia’, ‘Pikrolia Kerkiras’, ‘Romeiki’ ‘Smertolia’, ‘Thassitiki’, ‘Throubolia Aegean’ and ‘Valanolia’) were examined, concerning their phenol and oleuropein concentrations. Fruit antioxidant activity was determined, as well. The results showed that significant differences existed among cultivars, regardless of the tissue or the measured parameter. In general, leaves had higher total phenol and oleuropein concentrations than fruits. Finally, the highest oleuropein concentration was recorded in ‘Pikrolia Kerkiras’ followed by ‘Romeiki’, ‘Megaritiki’, ‘Kothreiki’, ‘Mastoidis’ and ‘Kalamon’. These cultivars may constitute the raw material in the industrial production of oleuropein.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραγόντων που επηρεάζουν τη συγκέντρωση της ελευρωπαΐνης σε ιστούς ή όργανα της ελιάς (Olea europaea L.). Οι παράγοντες που μελετήθηκαν ήταν δύο αβιοτικές καταπονήσεις (αλατότητα εδάφους και υδατική καταπόνηση), η αύξηση και ωρίμανση του ελαιοκάρπου, το σύστημα διαμόρφωσης των δένδρων και η θέση των φύλλων στην κόμη τους, καθώς και ο γενοτυπικός παράγοντας. Στο πρώτο πείραμα διερευνήθηκε η κατανομή των φαινολικών ενώσεων, ελευρωπαΐνης και υδροξυτυροσόλης, ως ανταπόκριση της ελιάς στην αλατότητα και στη συνεπακόλουθη οξειδωτική καταπόνηση, εστιάζοντας σε δύο φυτικά όργανα (φύλλα και ρίζα). Ακόμα, προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα και η πιθανή σχέση που μπορεί να υπάρχει με τις φαινoλικές ενώσεις. Επίσης, δεδομένου ότι η γλυκόζη αποτελεί μέρος του μορίου της ελευρωπαΐνης και παίζει ενεργό ρόλο στη διαδικασία της ωσμωτικής ρύθμισης, μελετήθηκε η υπόθεση αν υπάρχει στενή σχέση μεταξύ τους. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η αλατότητα προώθησε το σχηματισμό των ολικών φαινολών και της ελευρωπαΐνης, κυρίως στα φύλλα, ενώ η συγκέντρωση της υδροξυτυροσόλης μειώθηκε ή παρέμεινε αμετάβλητη. Η ελευρωπαΐνη ήταν η κύρια φαινολική ένωση και στους δύο ιστούς που μελετήθηκαν, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση NaCl. Η διακύμανση της συγκέντρωσης της γλυκόζης στα φύλλα ήταν αντίθετη από εκείνη της ελευρωπαΐνης και διαπιστώθηκε υψηλή αρνητική συσχέτιση μεταξύ των δύο αυτών ενώσεων (R = -0.90, -0.80, -0.88 and -0.84 για τις ποικιλίες ‘Zard’, ‘Ascolana’, ‘Κορωνέικη’ και ‘Arbequina’, αντίστοιχα). Αυτή η παρατήρηση μπορεί να δώσει μια νέα διάσταση στο ρόλο της ελευρωπαΐνης, δηλαδή το μόριο της να λειτουργεί ως δεξαμενή γλυκόζης προκειμένου να χρησιμοποιηθεί, είτε για τη διαδικασία της ωσμoρρύθμισης, είτε για διαδικασίες που απαιτούν κατανάλωση ενέργειας, έτσι ώστε να εγκλιματιστούν τα φυτά σε συνθήκες αλατότητας. Υψηλή συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των ολικών φαινολών και της αντιοξειδωτικής ικανότητας τόσο στα φύλλα όσο και στις ρίζες. Τέλος, δεν φαίνεται να υπάρχει κάποια ένδειξη μεταφοράς των φαινολικών ενώσεων μεταξύ ρίζας και φύλλων, ως αποτέλεσμα της αλατότητας. Η ελιά εκτίθεται συχνά σε έντονη υδατική καταπόνηση κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού. Έτσι, στο δεύτερο πείραμα προσδιορίστηκαν οι μεταβολές στα επίπεδα των ολικών φαινολών, της ελευρωπαΐνης και της υδροξυτυροσόλης τεσσάρων ποικιλιών ελιάς (‘Γαϊδουρελιά’, ‘Καλαμών’, ‘Κορωνέικη’ και ‘Μεγαρίτικη’), οι οποίες αναπτύσσονταν σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης για δύο μήνες. Επιπλέον, μελετήθηκαν η φωτοσυνθετική συμπεριφορά, ως προς την ανταλλαγή αερίων και το φθορισμό της χλωροφύλλης, η συγκέντρωση της μαλονδιαλδεΰδης και η αντιοξειδωτική ικανότητα. Γενικά, ο ρυθμός φωτοσύνθεσης, η στοματική αγωγιμότητα και ο λόγος Fv/Fm μειώθηκαν μόνο κατά την έντονη υδατική καταπόνηση. Όσον αφορά τη συγκέντρωση των ολικών φαινολών, της ελευρωπαΐνης και της υδροξυτυροσόλης παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές, τόσο μεταξύ των ποικιλιών όσο και μεταξύ των επιπέδων άρδευσης, έπειτα από 60 ημέρες έλλειψης νερού. Η συγκέντρωση των ολικών φαινολών αυξήθηκε στην έντονη υδατική καταπόνηση, ενώ η συγκέντρωση της ελευρωπαΐνης παρουσίασε μικρή αύξηση στην ήπια υδατική καταπόνηση και απότομη στην έντονη. Η συγκέντρωση της υδροξυτυροσόλης σημείωσε μία βαθμιαία μείωση καθώς εξελισσόταν η υδατική καταπόνηση. Η συγκέντρωση της μαλονδιαλδεΰδης αυξήθηκε εξαιτίας της έλλειψης νερού, κυρίως μετά από δύο μήνες, ενώ η αντιοξειδωτική ικανότητα αυξήθηκε σε όλες τις ποικιλίες στο τελευταίο επίπεδο υδατικής καταπόνησης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υδατική καταπόνηση επηρέασε τις φυσιολογικές και βιοχημικές παραμέτρους που μελετήθηκαν, ενώ ο βαθμός που επηρεάστηκαν εξαρτιόταν από την ένταση της υδατικής καταπόνησης, το γενότυπο και τη διάρκεια έκθεσης των φυτών σε έλλειψη νερού. Ο ρυθμός φωτοσύνθεσης μειώθηκε κυρίως λόγω του κλεισίματος των στομάτων, αλλά σε αυτό συνέβαλε και η ζημία του φωτοσυστήματος ΙΙ (PSII). Επιπρόσθετα, η υδατική καταπόνηση αύξησε τη συγκέντρωση των φαινολικών ενώσεων, και ειδικότερα της ελευρωπαΐνης, υπογραμμίζοντας το ρόλο τους ως αντιοξειδωτικά. Πράγματι, ο αντιοξειδωτικός τους ρόλος επιβεβαιώθηκε και από την υψηλή συσχέτιση που παρουσίασαν οι ενώσεις αυτές με την αντιοξειδωτική ικανότητα. Παρόλα αυτά, ο βαθμός της υδατικής καταπόνησης και η διάρκεια έκθεσης των φυτών σε αυτή, φαίνεται να υπερβαίνει την αντιοξειδωτική δράση, αφού τα επίπεδα μαλονδιαλδεΰδης και κατ’επέκταση η οξειδωτική ζημία αυξήθηκαν μετά από δύο μήνες υδατικής καταπόνησης. Τέλος, η ‘Γαιδουρελιά’ θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως ανθεκτική ποικιλία στην υδατική καταπόνηση, καθώς παρουσίασε την υψηλότερη φαινολική συγκέντρωση και αντιοξειδωτική ικανότητα και τη χαμηλότερη φωτοχημική ζημία και υπεροξείδωση των λιπιδίων. Η αύξηση του ελαιοκάρπου είναι μία πολύπλοκη και χρονοβόρα διαδικασία, κατά τη διάρκεια της οποίας λαμβάνουν χώρα αρκετές μεταβολικές αλλαγές. Ο σκοπός του τρίτου πειράματος ήταν να προσδιοριστούν οι μεταβολές στη συγκέντρωση των φαινολικών ενώσεων, του ασκορβικού οξέος και της αντιοξειδωτικής ικανότητας έξι ποικιλιών ελιάς κατά την αύξηση του καρπού. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι συγκεντρώσεις των ολικών φαινολών, της ελευρωπαΐνης, του ασκορβικού οξέος και της αντιοξειδωτικής ικανότητας ήταν υψηλές κατά την καρπόδεση και τη σκλήρυνση του ενδοκαρπίου και μειώθηκαν, όσο προχωρούσε η περίοδος ωρίμανσης. Ωστόσο, ο βαθμός μείωσης διέφερε, ανάλογα με την παράμετρο που μελετήθηκε. Από την άλλη μεριά, οι συγκεντρώσεις της υδροξυτυροσόλης και της τυροσόλης αυξήθηκαν ελαφρά κατά την ωρίμανση. Σε όλες τις ποικιλίες παρατηρήθηκε σημαντική αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στην ελευρωπαΐνη και την αύξηση του καρπού (R = -0.92, -0.93, -0.80, -0.88, -0.85 και -0.85 για τις ποικιλίες ‘Barnea’, ‘Χονδρολιά Χαλκιδικής’, ‘Γαϊδουρελιά’, ‘Καλαμών’, ‘Κορωνέικη’ και ‘Sevillano’, αντίστοιχα), αποκαλύπτοντας μία στενή σχέση μεταξύ τους. Επιπλέον, συγκρίνοντας τη συγκέντρωση της ελευρωπαΐνης με την πρωιμότητα ωρίμανσης κάθε ποικιλίας, φαίνεται ότι οι πρώιμες ποικιλίες ‘Sevillano’ και ‘Χονδρολιά Χαλκιδικής’ είχαν ελαφρώς χαμηλότερη συγκέντρωση ελευρωπαΐνης από ότι οι μέσης ή όψιμης ωρίμανσης ποικιλίες ‘Γαϊδουρελιά’, ‘Barnea’, ‘Καλαμών’ και ‘Κορωνέικη’. Η μείωση της συγκέντρωσης των ολικών φαινολών σχετίζεται, επίσης, με τα αγρονομικά χαρακτηριστικά του ελαιοκάρπου, λαμβάνοντας υπόψη την εποχή ωρίμανσης της εκάστοτε ποικιλίας. Τέλος, η συγκέντρωση του ασκορβικού οξέος ήταν υψηλή κυρίως στα πρώτα στάδια ωρίμανσης, ανεξάρτητα από την ποικιλία. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζεται η επίδραση του συστήματος διαμόρφωσης (θαμνώδες κύπελλο ή ελεύθερο σφαιρικό) και της θέσης των φύλλων στην κόμη των δέντρων, στη συγκέντρωση των ολικών φαινολών και της ελευρωπαΐνης στα φύλλα δύο ελληνικών ποικιλιών ελιάς (‘Καλαμών’ και ‘Χονδρολιά Χαλκιδικής’). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και στις δύο ποικιλίες η συγκέντρωση των ολικών φαινολών ήταν μεγαλύτερη στο θαμνώδες κύπελλο από ότι στο ελεύθερο σφαιρικό. Στην ‘Καλαμών’ η μέση συγκέντρωση των ολικών φαινολών ήταν 42.10 και 34.79 mg g-1 ν.β. στο θαμνώδες κύπελλο και το ελεύθερο σφαιρικό, αντίστοιχα, ενώ στη ‘Χονδρολιά Χαλκιδικής’ ήταν 36.24 και 25.86 mg g-1 ν.β., αντίστοιχα. Όσον αφορά τη θέση των φύλλων στην κόμη των δέντρων, και οι δύο ποικιλίες παρουσίασαν μεγαλύτερη συγκέντρωση ολικών φαινολών στα φύλλα του εξωτερικού τμήματος της κόμης, με εξαίρεση τα δέντρα σφαιρικής διαμόρφωσης της ‘Καλαμών’, στα οποία δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ανάμεσα στις δύο θέσεις. Το σύστημα διαμόρφωσης επηρέασε, επίσης, τη συγκέντρωση της ελευρωπαΐνης. Και στις δύο ποικιλίες τα δέντρα του θαμνώδους κυπέλλου είχαν μεγαλύτερη συγκέντρωση ελευρωπαΐνης από ότι εκείνα του ελεύθερου σφαιρικού. Συγκεκριμένα, οι τιμές της ‘Καλαμών’ ήταν 32.04 και 16.18 mg g-1 ν.β. για το θαμνώδες κύπελλο και το σφαιρικό σχήμα, αντίστοιχα, και για τη ‘Χονδρολιά Χαλκιδικής’ 30.26 και 11.73 mg g-1 ν.β., αντίστοιχα. Επιπλέον, η συγκέντρωση της ελευρωπαΐνης επηρεάστηκε από τη θέση των φύλλων στην κόμη. Η συγκέντρωση της ελευρωπαΐνης ήταν υψηλότερη στην περιφέρεια σε σχέση με το εσωτερικό και στα δύο συστήματα διαμόρφωσης, εκτός από το θαμνώδες κύπελλο της ‘Καλαμών’ που δεν παρατηρήθηκαν διαφορές. Η χημική σύσταση της ελιάς εξαρτάται από ορισμένους αγρονομικούς παράγοντες, ένας από τους οποίους είναι η ποικιλία. Έτσι, στην τελευταία μελέτη, εξετάστηκαν καρποί και φύλλα 15 ποικιλιών ελιάς (‘Ασπρολιά λευκόκαρπος’, ‘Γαλάτιστας’, Καλαμών’, ‘Κοθρέικη’, Μαρωνείας’, ‘Μαστοειδής’, ‘Μαυρολιά Μεσσηνίας’, ‘Μεγαρίτικη’, ‘Πετρολιά Σερρών’, ‘Πικρολιά Κέρκυρας’, ‘Ρωμέικη’, ‘Σμερτολιά’, ‘Θασίτικη’, ‘Θρουμπολιά Αιγαίου’ και ‘Βαλανολιά’) ως προς την συγκέντρωση ολικών φαινολών και ελευρωπαΐνης. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα των καρπών. Όσον αφορά τα αποτελέσματα, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ποικιλιών, ανεξάρτητα από τον ιστό ή την παράμετρο που μελετήθηκε. Γενικά, τα φύλλα παρουσίασαν υψηλότερη συγκέντρωση ολικών φαινολών και ελευρωπαΐνης από ότι οι καρποί. Τέλος, η υψηλότερη συγκέντρωση ελευρωπαΐνης καταγράφηκε στην ‘Πικρολιά Κέρκυρας’ και ακολούθησαν οι ποικιλίες ‘Ρωμέικη’, ‘Μεγαρίτικη’ ‘Κοθρέικη’ ‘Μαστοειδής’ και ‘Καλαμών’.