Νευροβιολογία της α-Συνουκλεΐνης

Abstract

α-synuclein (ASYN) is a neuronal protein implicated in Parkinson’s disease (PD) pathogenesis. Duplications/triplications or point mutations (A53T, A30P, E46K) in the gene encoding for ASYN lead to PD. However, the pathogenic effects of ASYN, and in particular of its mutant forms, are unknown. Such effects may be closely linked to ASYN degradation and its effects on intracellular protein degradation pathways. Previous studies, based on isolated liver lysosomes, have shown that wild type (WT) ASYN can be degraded by Chaperone Mediated Autophagy (CMA). In this selective degradation pathway, WT ASYN binds through its KEFQR motif to the receptor Lamp2a and is internalized and degraded within lysosomes. Moreover, it has been shown in the same in vitro lysosome system that mutant ASYNs block CMA by binding to Lamp2a without being internalized.In this study, we wished to examine in a neuronal cell context whether 1) WT ASYN can de degraded via CMA, 2) CMA dysfunction caused by mutant forms of ASYN is responsible for the impairment of lysosomal degradation, and 3) toxicity attributed to mutant ASYNs is due, in part, to the impairment of lysosomal function. To address the first question we generated stably tranfected inducible neuronal cell lines (human SH-SY5Y, rat PC12), expressing WT ASYN and the mutant ΔDQ/WT ASYN that lacks the CMA recognition motif. In these lines we compared the rate of degradation and half life of both forms. We, alternatively, assessed the effect of the downregulation of Lamp2a on the levels of WT ASYN. We concluded that WT ASYN can be degraded through CMA in both cell lines. To address the second/third question we generated stably tranfected inducible neuronal cell lines (human SH-SY5Y, rat PC12), expressing A53T ASYN and the mutant ΔDQ/A53T ASYN that lacks the CMA recognition motif. In these lines, we employed a pulse-chase assay to measure lysosomal function, and observed a significant decrease in total lysosomal degradation induced by A53T ASYN in large part due to CMA impairment. Nevertheless, no significant toxicity was detected. However, in neuronally differentiated SH-SH5Y cells both WT and A53T ASYN were associated with gradual toxicity, attenuated in the case of WT/ΔDQ. Pharmacological inhibition of dopamine synthesis lead to improvement of lysosomal function and cell survival, indicating that dopamine-modified ASYN can trigger lysosomal dysfunction due to CMA impairment, which can ultimately lead to increased to cell death. Therefore lysosomal degradation may be the target for therapeutic interventions in PD.

Η α-Συνουκλεΐνη είναι μια νευρωνική πρωτεΐνη, που εμπλέκεται στην παθογένεση της νόσου του Πάρκινσον. Διπλασιασμοί/τριπλασιασμοί ή σημειακές μεταλλάξεις (Α53Τ, Α30Ρ, Ε46Κ) του γονιδίου της οδηγούν στην εμφάνιση της οικογενούς νόσου. Αν και η αιτία για την παθογόνο δράση της ASYN δεν είναι πλήρως γνωστή, είναι πιθανό να σχετίζεται την επίδραση της στους μηχανισμούς αποικοδόμησης του κυττάρου. Σε προηγούμενη μελέτη σε ένα σύστημα απομονωμένων λυσοσωμάτων φάνηκε ότι η φυσικού τύπου (WT) ASYN μπορεί να αποικοδομηθεί από την Αυτοφαγία Διαμεσολαβούμενη από Τσαπερόνες (CMA). Για το σκοπό αυτό, η ASYN αναγνωρίζεται και προσδένεται μέσω του μοτίβου KEFQR στον υποδοχέα Lamp2a και στη συνέχεια εισέρχεται στο λυσοσωμικό αυλό, όπου αποκοδομείται. Επιπλέον, φάνηκε στο ίδιο in vitro σύστημα ότι οι μεταλλαγμένες μορφές της προσδένονται πολύ ισχυρά στον Lamp2a, χωρίς να εισέρχονται στο λυσόσωμα.Κατά την εκπόνηση της παρούσας μελέτης, θελήσαμε να απαντήσουμε σε νευρωνικές κυτταρικές σειρές τα εξής ερωτήματα: 1) μπορεί η ASYN να αποικοδομηθεί μέσω της CMA; 2) προκαλούν οι μεταλλαγμένες μορφές της ASYN λυσοσωμική δυσλειτουργία λόγω καταστολής της CMA; και 3) είναι η δυσλειτουργία αυτή, εν μέρει, υπεύθυνη για την τοξικότητα που συνοδεύει τις μορφές αυτές; Για απαντήσουμε το ερώτημα 1, κατασκευάσαμε μόνιμα διαμολυσμένες επαγόμενες νευρωνικές κυτταρικές σειρές (ανθρώπου SH-SY5Y, αρουραίου PC12), που εκφράζουν την WT και την ΔDQ/WT ASYN, που δεν διαθέτει το μοτίβο αναγνώρισης από την CMA. Στις σειρές αυτές κάναμε σύγκριση του ρυθμού αποικοδόμησης και της ημιζωής των μορφών αυτών. Επίσης, μελετήσαμε την επίδραση της καταστολής της έκφρασης του Lamp2a στα επίπεδα της WT ASYN. Καταλήξαμε στον συμπέρασμα ότι η WT ASYN μπορεί να αποικοδομηθεί μέσω της CMA και στις δυο αυτές σειρές. Στη συνέχεια, για να απαντήσουμε τα ερωτήματα 2 και 3, κατασκευάσαμε μόνιμα διαμολυσμένες επαγόμενες νευρωνικές κυτταρικές σειρές (ανθρώπου SH-SY5Y, αρουραίου PC12), που εκφράζουν την Α53T και την ΔDQ/Α53T ASYN, που δεν διαθέτει το μοτίβο αναγνώρισης από την CMA. Στις σειρές αυτές, παρατηρήσαμε, με τη χρήση μιας τεχνικής pulse-chase, μείωση της λυσοσωμικής αποικοδόμησης κατόπιν έκφρασης της Α53Τ ASYN, εξαιτίας καταστολής της CMA. Ωστόσο, η μείωση αυτή δεν συνοδεύτηκε από τοξικότητα. Παρ’ όλα αυτά, νευρωνική διαφοροποίηση των κυττάρων SH-SY5Y έδειξε σταδιακή μείωση της λυσοσωμικής λειτουργίας και αύξηση του κυτταρικού θανάτου, λόγω της παρουσίας της WT και A53T ASYN, η οποία αντιστράφηκε κατόπιν έκφρασης της ΔDQ/WT ASYN ή κατόπιν φαρμακολογικής καταστολής της σύνθεσης ντοπαμίνης. Επομένως, η λυσοσωμική αποικοδόμηση της ASYN μπορεί να αποτελέσει το στόχο νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων στην καταπολέμηση της νόσου του Πάρκινσον.