Μελέτη της ρύθμισης της L-DOPA αποκαρβοξυλάσης

Abstract

L-3,4-dihydroxyphenyl-alanine decarboxylase (L-Dopa decarboxylase, or DDC, EC 4.1.1.26) is the enzyme which catalyzes the decarboxylation of L-Dopa to dopamine. Until recently this enzyme was thought to be a rather unregulated molecule that is present is serotonergic and non serotonergic tissues, as well as peripheral organs, where the function of the enzyme is still largely unknown. Although the regulation of the DDC gene has been extensively studied at a transcriptional, post-transcriptional and translational level, the exact molecular mechanisms that govern its expression and regulation still remain under investigation. DDC has been implicated in many pathological conditions it is accepted that the enzyme’s regulatory mechanisms play an important role in Parkinson’s disease, cancer and schizophrenia. For all the above reasons, DDC constitutes subject of an extensive study at a biochemical, as well as molecular and developmental biology level. The aim of the present dissertation was the study of the regulation of L-Dopa decarboxylase.The first axis of the related experimental approaches was to study the regulation of DDC expression in human cancer cell lines of neural and non-neural origin. It was detected, for the first time, the expression of the neural and non-neural type full-length transcript of DDC, as well as the expression of the alternative protein isoform, Alt-DDC in SH-SY5Y (human neuroblastoma), HeLa (human cervical adenocarcinoma) and HTB-14 (human glioblastoma-astrocytoma) cells.In order to study the regulation of DDC expression, we investigated the cellular topology of the full-length DDC, the alternative isoform ALT-DDC and its endogenous inhibitor Annexin V in cell lines of neural and non-neural origin. Temperature-induced phase separation in the presence of the non-anionic detergent Triton X-114 led to the recovery of DDC, Alt-DDC and Annexin V protein molecules in all three separation phases in cell lines SH-SY5Y (human neuroblastoma), HTB-14 (human glioblastoma-astrocytoma) and HEK-293 (human embryonic kidney cells). The cellular topology heterogeneity of the molecules suggests that complex mechanisms are involved in the regulation of the expression of the full-length DDC and the alternative isoform Alt-DDC.Due to the localization of DDC and Alt-DDC in all separation phases in the studied cell lines, we proceeded to further investigation of this phenomenon by studying the possibility of DDC solubilization from membrane fraction in HEK-293 cells. Solubilization of membrane-associated DDC was observed in a pH and time-dependent manner and was affected by divalent cations and serine and cysteine protease inhibitors. Furthermore, our data indicated that only a portion of the membrane-associated DDC molecules were released into the soluble fraction, suggesting the involvement of a possible regulated mechanism in the enzymatic activity of the molecule. In order to study DDC expression and enzymatic activity regulation, we investigated the interactions of the enzyme with other molecules. Immunoprecipitation experiments under non-denaturating conditions resulted in the detection of possible interaction between DDC and the endogenous inhibitor Annexin V in the soluble fraction of human placenta, the neural origin cell line SH-SY5Y and the epithelial origin cell line HeLa.It was, also, found a possible interaction between the alternative isoform Alt-DDC and Annexin V in the soluble fraction of human placenta. Immunoprecipitation of DDC enzymatic activity by Annexin V in SH-SY5Y and PC12 (rat pheochromocytoma) cells enhances the likelihood of the two molecules interaction.The study of DDC inhibition by endogenous and chemical inhibitors is very important for understanding the enzyme regulation mechanism. For this reason, it was investigated the effect of chemical inhibitors of DDC enzymatic activity and endogenous inhibitor isolated from human serum in cell lines of non-neural origin, in the present work. It was found, for the first time, that carbidopa was cytotoxic to HeLa (cervical adenocarcinoma) and MCF7 (human breast adenocarcinoma) cells. Instead, the chemical inhibitor NSD-1015 and the endogenous inhibitor isolated from human blood serum had no cytotoxic effects against the specific cell lines. The fact that DDC has been proposed as a diagnostic marker of cancer cells of neuroendocrine origin and as an marker of the embryonic origin and the growth and differentiation rate of the tumor, indicates the importance of the regulatory molecules of DDC enzymatic activity in the development of future chemotherapeutic approaches. To further study the regulation phenomenon, we proceeded to the investigation of the interaction of DDC and ALT-DDC with Annexini V system in eukaryotic CHO cells (Chinese Hamster Ovary cells). These cells do not express dopamine transporters DAT and VMAT-2 and L-Dopa Decarboxylase-expressing CHO cells are used to model DA-producing neurons. Initially, the coding region of Annexin V was subcloned into the eukaryotic expression vector, pcDNA 3.1 +. The recombinant vectors with the coding regions of the full-length DDC, the alternative isoform Alt-DDC and the endogenous inhibitor Annexin V were transfected into CHO cells, through electroporation. DDC enzymatic activity experiments certified the involvement of Annexin V in the DDC enzymatic activity regulation and confirmed previous data from our laboratory supporting its inhibitory activity. Effect of the inhibitory molecules Annexin V and carbidopa on the DDC enzymatc activity in apoptotic cells, suggested that DDC enzymatic activity regulation is, possibly, involved in apoptotic phenomena.DDC has been implicated in many pathological conditions such as Parkinson’s disease, cancer and schizophrenia. L-Dopa decarboxylase does not seem to be directly related to the etiology of Parkinson’s disease, but it is accepted that the enzyme’s regulatory mechanisms play an important role in the treatment of this disease. For these reasons, the study of DDC regulation is of particular interest, because it could contribute to the development of new experimental approaches and ultimately of new pharmacological and therapeutic tools against neurodegenerative and neoplastic diseases.

Η L-3,4 διυδροξυ-φαινυλ-αλανίνη αποκαρβοξυλάση (L-Dopa αποκαρβοξυλάση, L-Dopa decarboxylase ή DDC, EC 4.1.1.26) είναι το ένζυμο το οποίο καταλύει την αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa σε ντοπαμίνη. Έως πρόσφατα το ένζυμο αυτό εθεωρείτο ένα μάλλον μη ρυθμιζόμενο μόριο το οποίο ανιχνεύεται σε σεροτονεργικούς και μη σεροτονεργικούς νευρώνες, καθώς επίσης σε περιφερικά όργανα, όπου η λειτουργία του ενζύμου δεν είναι ακόμα γνωστή. Αν και η ρύθμιση του γονιδίου της DDC έχει μελετηθεί εκτενώς σε μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την έκφραση και τη ρύθμιση παραμένουν υπό διερεύνηση. Η DDC εμπλέκεται σε παθολογικές καταστάσεις και είναι αποδεκτό πως οι μηχανισμοί ρύθμισης του ενζύμου παίζουν σημαντικό ρόλο στη νόσο του Parkinson, τον καρκίνο και τη σχιζοφρένεια. Για τους παραπάνω λόγους η DDC αποτελεί αντικείμενο εκτεταμένης μελέτης τόσο σε βιοχημικό επίπεδο, όσο και σε επίπεδο μοριακής και αναπτυξιακής βιολογίας. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της ρύθμισης της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC). Ο πρώτος άξονας των πειραματικών προσεγγίσεων αφορούσε στη μελέτη της ρύθμισης έκφρασης της της DDC σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές νευρικής και μη νευρικής προέλευσης. Στα κύτταρα SH-SY5Y (ανθρώπινο νευροβλάστωμα), HeLa (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα τραχήλου μήτρας) και ΗΤΒ-14 (ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα-αστροκύτωμα) ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά έκφραση του νευρικού και μη νευρικού τύπου μεταγράφου της πλήρους μήκους DDC, καθώς και έκφραση της εναλλακτικής πρωτεϊνικής ισομορφής της, Alt-DDC. Στα πλαίσια της μελέτης της ρύθμισης της έκφρασης της DDC, διερευνήθηκε η κυτταρική τοπολογία της πλήρους μήκους DDC, της εναλλακτικής ισομορφής Αlt-DDC και του φυσικού αναστολέα Aννεξίνη V σε κυτταρικές σειρές νευρικής και μη νευρικής προέλευσης. Πειράματα θερμοεπαγώμενου διαχωρισμού των πρωτεϊνών με χρήση του μη ανιονικού απορρυπαντικού Triton X-114 στις κυτταρικές σειρές SH-SY5Y (ανθρώπινο νευροβλάστωμα), HTB-14 (ανθρώπινο γλοιοβλάστωμα-αστροκύτωμα) και ΗΕK-293 (ανθρώπινα εμβρυονικά νεφρικά κύτταρα) έδειξαν εντοπισμό της DDC, της Alt-DDC και της Αννεξίνης V σε όλες τις φάσεις διαχωρισμού. Η ετερογένεια στην κυτταρική τοπολογία των μορίων, υποδηλώνει την πολυπλοκότητα στη ρύθμιση της έκφρασης της πλήρους μήκους και της εναλλακτικής ισομορφής της DDC. Λόγω του εντοπισμού της DDC και της Alt-DDC σε όλες τις φάσεις διαχωρισμού στις υπό μελέτη κυτταρικές σειρές ακολούθησε περαιτέρω διερεύνηση του φαινομένου αυτού, μελετώντας της πιθανότητα απελευθέρωσης της DDC από το μεμβρανικό κλάσμα στα κύτταρα ΗΕΚ-293. Η διαλυτοποίηση των μεμβρανοσυνδεόμενων μορίων της DDC βρέθηκε ότι εξαρτάται από τη επίδραση του pH, το χρόνο επώασης και τις συγκεντρώσεις δισθενών κατιόντων και αναστολέων πρωτεασών κυστεΐνης και σερίνης. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ένα μέρος των μεμβρανοσυνδεόμενων μορίων απελευθερώνεται στο διαλυτό κλάσμα, υποδεικνύοντας έναν πιθανό μηχανισμό για τη ρύθμιση της ενζυμικής ενεργότητας του μορίου. Στα πλαίσια της ρύθμισης της έκφρασης και της ενζυμικής ενεργότητας της DDC, διερευνήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του ενζύμου με άλλα μόρια, καθώς με τον τρόπο αυτό μπορούν να προκύψουν σημαντικά συμπεράσματα ως προς τον τρόπο δράσης του, αλλά και τους παράγοντες που αναστέλλουν την ενεργότητά του. Με τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης σε μη αποδιατακτικές συνθήκες βρέθηκε πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ της DDC και του φυσικού αναστολέα Aννεξίνη V σε διαλυτό κλάσμα ανθρώπινου πλακούντα, στην κυτταρική σειρά νευρικής προέλευσης SH-SY5Y, αλλά και στην κυτταρική σειρά επιθηλιακής προέλευσης HeLa. Επίσης, πιθανή αλληλεπίδραση εντοπίστηκε μεταξύ της εναλλακτικής ισομορφής Alt-DDC και της Aννεξίνης V σε διαλυτό κλάσμα ανθρώπινου πλακούντα. Πειράματα κατακρήμνισης της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στα κύτταρα SH-SY5Y και PC12 (φαιοχρωμοκύτωμα αρουραίου) από την Aννεξίνη V ενισχύουν την πιθανότητα αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο μορίων.Η μελέτη του τρόπου δράσης των ενδογενών και χημικών αναστολέων της DDC θεωρείται πολύ σημαντική για τη κατανόηση της ρύθμισης του ενζύμου. Για το λόγο αυτό, στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε επίδραση χημικών αναστολέων της ενζυμικής ενεργότητας της DDC και του ενδογενούς αναστολέα της που έχει απομονωθεί από ανθρώπινο ορό, σε κυτταρικές σειρές μη νευρικής προέλευσης. Για πρώτη φορά, βρέθηκε ότι η καρβιντόπα παρουσίασε κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα HeLa (αδενοκαρκίνωμα τραχήλου μήτρας) και στα κύτταρα MCF7 (αδενοκαρκίνωμα μαστού ανθρώπου). Αντίθετα, ο χημικός αναστολέας NSD-1015 και ο ενδογενής αναστολέας που απομονώνεται από τον ορό ανθρώπινου αίματος δεν προκάλεσαν φαινόμενα κυτταροτοξικότητας απέναντι στις συγκεκριμένες κυτταρικές σειρές. Το γεγονός ότι η DDC έχει προταθεί ως διαγνωστικός δείκτης καρκινικών κυττάρων νευροενδοκρινούς προέλευσης, καθώς και ως δείκτης της εμβρυονικής προέλευσης, του βαθμού ανάπτυξης και διαφοροποίησης του όγκου, υποδεικνύουν τη σημασία των ρυθμιστικών μορίων της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στην ανάπτυξη μελλοντικών χημειοθεραπευτικών προσεγγίσεων.Για την περαιτέρω μελέτη του φαινομένου, σχεδιάστηκε η μελέτη της αλληλεπίδρασης της DDC και της Αlt-DDC με την Aννεξίνη V σε ευκαρυωτικό σύστημα CHO κυττάρων (Chinese Hamster Ovary cells), τα οποία δεν εκφράζουν τους μεταφορείς ντοπαμίνης DAT και VMAT-2 και τα επιμολυσμένα κύτταρα CHO που εκφράζουν τη DDC χρησιμοποιούνται ως μοντέλο ντοπαμινεργικών νευρώνων. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση της κωδικοποιούσας περιοχής γονιδίου της Aννεξίνης V και εισαγωγή του cDNA στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pcDNA 3,1+. Στη συνέχεια, επιμολύνθηκαν ευκαρυωτικά κύτταρα CHO, μέσω ηλεκτροδιάτρησης, με τις κωδικοποιούσες περιοχές των γονιδίων των ανασυνδυασμένων μορίων της πλήρους μήκους DDC, της εναλλακτικής ισομορφής Αlt-DDC και του φυσικού αναστολέα Aννεξίνη V. Πειράματα προσδιορισμού της ενζυμικής ενεργότητας της DDC, πιστοποίησαν τη συμμετοχή της Αννεξίνης V στη ρύθμιση της ενζυμικής ενεργότητας της DDC και επιβεβαίωσαν παλαιότερα δεδομένα του εργαστηρίου μας που υποστήριζαν την ανασταλτική δράση της. Διερεύνηση της επίδρασης των ανασταλτικών μορίων Αννεξίνη V και καρβιντόπα στην ενζυμική ενεργότητα της DDC σε αποπτωτικά κύτταρα, έδειξε πιθανή συμμετοχή της DDC στην επαγωγή αποπτωτικών φαινομένων.Η DDC εμπλέκεται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως στη νόσο του Parkinson, τον καρκίνο και τη σχιζοφρένεια. Η L-Dopa αποκαρβοξυλάση δεν φαίνεται να σχετίζεται άμεσα με την αιτιολογία της ασθένειας του Parkinson, είναι όμως αποδεκτό πως οι μηχανισμοί ρύθμισης του ενζύμου παίζουν σημαντικό ρόλο για τη θεραπεία της συγκεκριμένης ασθένειας. Για τους παραπάνω λόγους, η μελέτη της ρύθμισης της DDC παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι θα μπορούσε να συμβάλλει σε νέες πειραματικές προσεγγίσεις, οι οποίες θα έχουν ως τελικό στόχο την ανάπτυξη νέων φαρμακολογικών και θεραπευτικών μέσων για την καταπολέμηση νευροεκφυλιστικών και νεοπλασματικών νόσων.