Διερεύνηση της σχέσης των μιτοχονδρίων και της α-synuclein στα χαρακτηριστικά του νευρικού κυττάρου που σχετίζονται με τη νόσο του Parkinson: αποκάλυψη ενός νέου ρόλου για τη μιτοχονδριακή πρωτεάση LonP1

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a progressive, neurodegenerative movement disorder that affects approximately 1% of adults aged 60 and over. It is characterized by the selective degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra, accumulation of α-synuclein fibrils, and impaired mitochondrial function. Mitochondrial dysfunction induces α-syn aggregation, which constitutes the main component of Lewy bodies. Moreover, α-syn can lead to a dose-dependent loss of mitochondrial transmembrane potential (Δψm). The mechanisms underlying the interplay between α-syn and mitochondrial dysfunction, as well as their potential involvement in neurodegeneration are not yet clear. The aim of this thesis was the generation of relevant cellular models for investigating molecular interactions and signaling pathways that are involved in the progressive appearance of PD-related cell phenotypes, focusing on the influence of α-synuclein in mitochondrial function. As such models, we considered the exposure of neuronal cells in conditions that lead to mitochondrial impairment, namely the presence of neurotoxins that increase the load of free radicals, and the generation cytoplasmic hybrid cells (cybrids) by replacing the mitochondria of healthy neuronal cells with the mitochondria from patients with inherited forms of the disease. We developed and characterized both models. In order to develop the chronic model, the SHSY5Y cells were cultured under conditions of mild but continuous (chronic) oxidative stress challenge with the neurotoxin 6-OHDA. By using a series of biochemical and cell biology approaches we demonstrated that this system can faithfully recapitulate many of the key PD features that have been reported in previous in vitro and in vivo studies, in a chronological order. In this model we have identified a new role of the mitochondrial protease LonP1 in the nucleus and specifically in the chromatin, probably important for the progression of Parkinson's disease. Focusing on the mitochondrial function, we developed cybrid cell lines containing mitochondria from patients with the inherited form of PD as well as from healthy relatives. We characterized basic cellular properties such as mitochondria function, proliferation and differentiation potential, and examined possible nucleotide changes using next generation sequencing approaches (deep sequencing). Although no differences were detected between «PD» and «healthy» cybrids, these cell lines constitute a valuable experimental model, which in conjuction with the chronic stress model could be explored in future studies to contribute to the understanding of the role of mitochondria dysfunction in Parkinson's disease.

Η νόσος του Parkinson (PD) είναι μια προοδευτική κινητική νευροεκφυλιστική διαταραχή η οποία προσβάλλει περίπου το 1% των ενηλίκων ηλικίας άνω των 60 ετών. Οφείλεται στην εκλεκτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας και χαρακτηρίζεται από συσσώρευση συσσωματωμάτων ινιδιακής μορφής της πρωτεΐνης α-synuclein και εξασθένηση της μιτοχονδριακής λειτουργίας. Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία επάγει τη συσσωμάτωση της α-synuclein, η οποία αποτελεί το κύριο συστατικό των σωματίων του Lewy. Επιπλέον η α-synuclein μπορεί να οδηγήσει σε δοσοεξαρτώμενη απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης Δψm. Οι μηχανισμοί που διέπουν την αλληλεπίδραση μεταξύ της α-synuclein και τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία καθώς και η πιθανή συμμετοχή τους στη νευροεκφύλιση δεν είναι ακόμη σαφείς. Στόχος της διατριβής ήταν η δημιουργία κατάλληλων κυτταρικών μοντέλων για τη διερεύνηση των μοριακών αλληλεπιδράσεων και των σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην προοδευτική εκδήλωση της νόσου του Parkinson, με επίκεντρο την επίδραση της α-synuclein στη μιτοχονδριακή λειτουργία. Ως τέτοια μοντέλα επιλέξαμε την ανάπτυξη ενός in vitro συστήματος για τη μελέτη του προοδευτικού χαρακτήρα της νόσου του Parkinson κάτω από συνθήκες οξειδωτικού stress, καθώς και τη δημιουργία μιας ιδιαίτερης κατηγορίας υβριδικών κυττάρων (cybrids) αντικαθιστώντας τα μιτοχόνδρια υγιών νευρικών κυττάρων με τα μιτοχόνδρια ασθενών με κληρονομικές μορφές της νόσου. Αναπτύξαμε και χαρακτηρίσαμε και τα δύο μοντέλα. Για την ανάπτυξη του χρόνιου μοντέλου, καλλιεργήθηκαν τα κύτταρα SHSY5Y, υπό συνθήκες ήπιας συνεχούς (χρόνιας) πρόκλησης οξειδωτικού stress με τη νευροτοξίνη 6-OHDA. Με μια σειρά βιοχημικών και κυτταροβιολογικών μεθόδων αποδείξαμε ότι στο σύστημα αυτό αναπαράγονται πολλά από τα παρκινσονιακά χαρακτηριστικά που έχουν κατά καιρούς αναφερθεί σε in vitro και in vivo μελέτες, και μάλιστα με μια συγκεκριμένη χρονική ακολουθία. Τα πειράματά μας αποκάλυψαν για πρώτη φορά, μια πιθανή σύνδεση της πρωτεΐνης LonP1 με την εμφάνιση παθολογικών χαρακτηριστικών της νόσου στα νευρικά κύτταρα, όπως η συσσωμάτωση της α-synuclein και η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Σε αυτό ταυτοποιήσαμε έναν νέο ρόλο για την μιτοχονδριακή πρωτεάση LonP1 στον πυρήνα και συγκεκριμένα στη χρωματίνη, πιθανά σημαντικό για την πορεία της νόσου Parkinson. Εστιάζοντας στη μιτοχονδριακή λειτουργία, εγκαθιδρύσαμε και αναπτύξαμε υβριδικές κυτταρικές σειρές, οι οποίες περιέχουν μιτοχόνδρια ασθενών με την κληρονομική μορφή της νόσου του Parkinson, καθώς και από υγιή συγγενικά τους άτομα. Ακολούθησε πλήρης χαρακτηρισμός αυτών των σειρών, όσον αφορά βασικές κυτταρικές ιδιότητες όπως είναι η λειτουργικότητα των μιτοχονδρίων, ο πολλαπλασιασμός και η ικανότητα διαφοροποίησής τους, και έγινε έλεγχος του βαθμού των νουκλεοτιδικών αλλαγών που έχουν συσσωρευτεί στη μιτοχονδριακή αλληλουχία, με μεθοδολογία αλληλούχισης νέας γενιάς (deep sequencing). Παρότι δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές μεταξύ «PD» και «υγιών» cybrids, τα κύτταρα αυτά παραμένουν στη διάθεσή μας ως ένα πολύτιμο πειραματικό μοντέλο το οποίο σε συνδυασμό με το μοντέλο του χρόνιου stress θα μπορούσε μελλοντικά να συμβάλλει στην κατανόηση του ρόλου της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας στην νόσο του Parkinson.