Μελέτη της αντιμικροβιακής δράσης αιθέριων ελαίων

Abstract

During the last decade the scientific community is trying to cope with the emergence of pathogens resistant to currently available antimicrobials. The impact of antibiotic resistant microorganisms on human health, society and economy is large. In addition, substances with antimicrobial effect are increasingly used as food preservatives thus reinforcing the emergence of resistant microorganisms, not to mention their direct impact on consumers’ health. As a result, during the recent years research in the field of new antimicrobials has been intensified. Luckily, Mother Nature has a plethora of natural substances and extracts with a huge structural and biological diversity, which have infinite potentials for the development of new antimicrobial drugs. The objective of the present doctoral thesis was the investigation of the antimicrobial effect of five different plant essential oils towards various ATCC and wild bacterial and fungal strains, both susceptible and resistant to currently used antimicrobials. More specifically, the antimicrobial activity of essential oils derived from basil, thyme, oregano, tea tree and chamomile, was studied towards the following bacterial and fungal strains: - 41 multi-resistant bacterial strains and 12 strains of Candida spp isolated from equal number of hospitalized patients (University Hospital of Ioannina, Greece) - 11 bacterial strains isolated from various food and water samples. - 9 ATCC strains. The automated VITEK II system (Bio-merieux, France), the agar disk-diffusion method (Bauer-Kirby) and the E-test were employed for the susceptibility testing. The essential oils used in this study were commercially available by Sigma Aldrich Chemie GmbH (Germany), while their main compounds were identified by Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS). The antimicrobial activity of the employed essential oils was tested using the broth serial dilution method for the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum bactericidal concentration (MBC) and the time-kill kinetics. Also the viable plate counts and the optical density method were used in addition to the broth serial dilution method. All experiments were performed in duplicate. The results demonstrated that with the exception of the chamomile oil, all the rest essential oils exhibited significant antimicrobial activity towards the tested microbial strains. The essential oils of oregano and thyme exhibited the strongest antimicrobial activity towards Gram (+) bacterial strains with minimum MIC 0,063% v/v. The essential oils of tea-tree, oregano and thyme had the strongest antimicrobial activity towards Gram (-) bacterial strains with minimum MIC 0,125% v/v. Concerning the Candida spp strains all essential oils - except the chamomile oil, displayed similar antimicrobial activity, with minimum MIC 0,063% v/v. The overall range of MIC was from 0,063 v/v to >4% v/v. The determination of MIC using the viable plate count method produced more reliable results compared to the optical density method. According to the results of the present experimental study, the employed essential oils reveal significant antimicrobial activity in vitro towards both susceptible and multi- resistant microorganisms. Conclusively, the plant essential oils have a very good potential to be used as antimicrobials; however there is an urgent need for identification of the hidden compounds encompassing the true antimicrobial effect, which actually should be extracted or synthesized in pure form for future use in the Pharmaceutical and Food Industry.

Η επιστημονική κοινότητα την τελευταία 10ετία έχει έρθει αντιμέτωπη με το οξύ πρόβλημα της αύξησης των ανθεκτικών μικροοργανισμών στα αντιβιοτικά, το οποίο έχει πάρει μεγάλες διαστάσεις με κοινωνικές και οικονομικές προεκτάσεις. Ταυτόχρονα η αυξανόμενη χρήση των συντηρητικών στα τρόφιμα προκαλεί επίσης ανησυχία, αφού και αυτά συμβάλλουν στην ενίσχυση της αντιβιοαντοχής των μικροοργανισμών, ενώ παράλληλα πολλά από αυτά θεωρούνται επιβλαβή για την υγεία. Ως εκ τούτου τα τελευταία χρόνια έχει εντατικοποιηθεί η έρευνα στον τομέα της αναζήτησης νέων αντιμικροβιακών ουσιών. Η φύση παρέχει πληθώρα συστατικών και εκχυλισμάτων με μεγάλη δομική και βιολογική πολυμορφία, που παρέχουν απεριόριστες δυνατότητες για την ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών ουσιών. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο έλεγχος της αντιμικροβιακής δράσης πέντε αιθέριων ελαίων έναντι ευαίσθητων και πολυανθεκτικών κλινικών βακτηριακών στελεχών και μυκήτων, καθώς και πρότυπων στελεχών. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η δράση των πρότυπων αιθέριων ελαίων του βασιλικού, του θυμαριού, της ρίγανης, του τεϊόδενδρου και του χαμομηλιού έναντι: - 41 πολυανθεκτικών κυρίως, βακτηριακών στελεχών και 12 κλινικών στελεχών του γένους Candida spp που απομονώθηκαν από ισάριθμους ασθενείς του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. - 11 στελεχών βακτηρίων που απομονώθηκαν από τρόφιμα και νερά. - 9 πρότυπων ATCC στελεχών. Για τον έλεγχο ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά χρησιμοποιήθηκαν το αυτοματοποιημένο σύστημα VITEK II (Bio merieux, France), η μέθοδος διάχυσης σε άγαρ Bauer-Kirby και το E-test. Τα πρότυπα αιθέρια έλαια που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από την εταιρεία Sigma Aldrich Chemie GmbH (Germany) και για την ταυτοποίηση των κύριων δομικών τους συστατικών χρησιμοποιήθηκε η αέριος χρωματογραφία με φασματογράφο μάζας (GC-MS). Η αντιμικροβιακή δράση των ελαίων έναντι των μικροβιακών στελεχών που εξετάσθηκαν, μελετήθηκε με τη μέθοδο των αραιώσεων σε ζωμό, με την οποία προσδιορίσθηκε η ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα (MIC), η ελάχιστη βακτηριοκτόνος πυκνότητα (MBC) και η κινητική θανάτωσης των βακτηρίων (time-kill kinetic), με την καταμέτρηση των αποικιών σε άγαρ (viable counts) και τη μέθοδο της οπτικής πυκνότητας (optical density method). Όλοι οι πειραματισμοί έγιναν εις διπλούν. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι τα αιθέρια έλαια που χρησιμοποιήθηκαν με εξαίρεση το έλαιο του χαμομηλιού, παρουσίασαν αξιοσημείωτη αντιμικροβιακή δράση έναντι των εξεταζόμενων στελεχών. Τα αιθέρια έλαια της ρίγανης και του θυμαριού εμφάνισαν την ισχυρότερη δράση έναντι των Gram (+) βακτηρίων με μικρότερη τιμή MIC 0,063% v/v. Τα αιθέρια έλαια του τεϊόδενδρου, της ρίγανης και του θυμαριού εμφάνισαν την ισχυρότερη δράση έναντι των Gram (-) βακτηρίων με μικρότερη τιμή MIC 0,125% v/v. Στους μύκητες η δράση των αιθέριων ελαίων ήταν ισοδύναμη με εξαίρεση την ανενεργή δράση του ελαίου του χαμομηλιού, ενώ η μικρότερη τιμή MIC ήταν 0,063% v/v. Συνολικά το εύρος των τιμών MIC κυμάνθηκε από 0,063 v/v έως >4% v/v. Ο προσδιορισμός των τιμών MIC με τη μέθοδο της καταμέτρησης των αποικιών σε άγαρ εμφάνισε περισσότερο αξιόπιστα αποτελέσματα σε σχέση με την αντίστοιχη μέθοδο της οπτικής πυκνότητας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, τα αιθέρια έλαια παρουσιάζουν αξιοσημείωτη δράση in vitro έναντι ευαίσθητων και πολυανθεκτικών μικροοργανισμών. Μελλοντικά, αφού ταυτοποιηθούν πλήρως οι χημικές ενώσεις των αιθέριων ελαίων, που εμφανίζουν τη συγκεκριμένη αντιμικροβιακή δράση, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη Φαρμακοβιομηχανία και στη Βιομηχανία Τροφίμων για την παρασκευή νέων αντιμικροβιακών φαρμάκων και νέων πιο ασφαλών συντηρητικών.