Μοριακή ανάλυση της στόχευσης και μεταφοράς προπρωτεϊνών από την Sec Μεταθετάση

Abstract

More than 30% of the bacterial proteome functions in the cell periphery or outside the cell it is produced. For that reason an array of sixteen systems that transport membrane and secretory proteins has been produced during evolution. Of these, only the Sec secretion pathway is ubiquitous and essential for life. The majority of the secretory proteins destined for the periplasm or the outer bacterial membrane, by-pass the inner membrane through the Sec translocase. Translocase holoenzyme consists of a SecYEG preprotein conducting channel and an ATPase, SecA. The preprotein conducting channel transports the polypeptides to the periplasm or place them into the lipid bilayer. The ATPase pushes processively the polypeptide chains into the channel through multiple rounds of ATP hydrolysis. In this study we have focused on the way that preproteins are targeted to the Sec-translocase and eventually get secreted. We have developed the proper substrates and established that secretory preproteins are targeted through SecA to the SecYEG conducting channel. The mature domain is recognized by SecA and is responsible for targeting secretory preproteins only if present in a “non-native” state. This way of targeting is independent of signal peptides and SecB chaperone and probably generic in all bacteria. After the mature domain gets targeted to the translocase holoenzyme, the signal peptide “catalyzes” its translocation through two ordered events. Firstly the signal peptide lowers translocase activation energy by loosening interactions between the two sub-domains of the “DEAD” motor. After that, the physical presence of the signal peptide in its SecA groove causes detachment between the two sub-domains of the ATPase motor inducing multiple rounds of ATP hydrolysis and cycles of SecA membrane insertion and de-insertion, events that cause translocation of the polypeptide chain to the periplasm. The results of this study clarify some key points of the molecular mechanism of the Sec secretion system and encourage a radical revision of the current dogma on bacterial preprotein recognition and the role of the signal peptides in preprotein translocation

Πάνω από το 30% του βακτηριακού πρωτεώματος λειτουργεί στην επιφάνεια ή εκτός του κυττάρου στο οποίο παράχθηκε. Για τον λόγο αυτό η εξέλιξη δημιούργησε δεκαέξι μονοπάτια μεταφοράς μεμβρανικών και εκκριτικών πρωτεϊνών. Από αυτά μόνο το Sec μονοπάτι είναι πανταχού παρόν και αναγκαίο για την βιωσιμότητα του βακτηριακού κυττάρου. Η πλειοψηφία των εκκριτικών πρωτεϊνών που προορίζονται για το περίπλασμα ή την εξωτερική μεμβράνη του βακτηρίου, διαπερνούν την εσωτερική μεμβράνη μέσω της Sec μεταθετάσης. Το ολοένζυμο της μεταθετάσης αποτελείται από το SecYEG κανάλι μετατόπισης και από την ΑΤΡάση του συστήματος, SecA. Το κανάλι μετατόπισης έχει την δυνατότητα να μεταφέρει τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες από το κυτταρόπλασμα στο περίπλασμα ή να τις ενθέτει στην λιπιδική διπλοστοιβάδα. Η ΑΤΡάση ωθεί σταδιακά, πραγματοποιώντας κύκλους υδρόλυσης, τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες στο κανάλι μετατόπισης. Η εύρεση του τρόπου με τον οποίο οι εκκριτικές πρωτεΐνες στοχεύονται και μετατοπίζονται από την Sec μεταθετάση αποτέλεσε το αντικείμενο της παρούσας διατριβής. Με την ανάπτυξη κατάλληλων υποστρωμάτων διαπιστώσαμε ότι οι εκκριτικές πρωτεΐνες στοχεύονται μέσω της SecA στο SecYEG κανάλι μετατόπισης. Το ώριμο τμήμα των εκκριτικών πρωτεϊνών είναι αυτό το οποίο αναγνωρίζεται από την ATPάση του συστήματος και σε αυτό οφείλεται η στόχευση των εκκριτικών πρωτεϊνών, αρκεί να βρίσκεται σε μια μη-εγγενή στερεοδιαμόρφωση. Ο τρόπος αυτός στόχευσης είναι ανεξάρτητος του πεπτιδίου σήμα και της σαπερόνης SecB και πιθανόν γενικός για όλα τα βακτήρια. Μετά την στόχευση του ώριμου τμήματος στο ολοένζυμο της μεταθετάσης το πεπτίδιο σήμα “καταλύει” την μετατόπισή του, μέσω δύο διακριτών συμβάντων. Αρχικά το πεπτίδιο σήμα προκαλεί μείωση της ενέργειας ενεργοποίησης της μεταθετάσης μέσω της εξασθένησης των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των δύο περιοχών του “DEAD” κινητήρα της SecA. Στην συνέχεια η φυσική παρουσία του πεπτιδίου σήμα στο αυλάκι πρόσδεσης του, στην SecA προκαλεί αποκόλληση των δύο περιοχών του κινητήρα της SecA έτσι ώστε να πραγματοποιηθούν πολλαπλοί κύκλοι υδρόλυσης και εισαγωγής- εξαγωγής της SecA στο κανάλι μετατόπισης, οι οποίοι οδηγούν την μετατόπιση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο περίπλασμα. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής ξεκαθαρίζουν πολλά σημεία της μοριακής βάσης της Sec-εξαρτώμενης μετατόπισης προπρωτεϊνών και προτρέπουν σε μια δραστική αναθεώρηση του δόγματος περί της στόχευσης των εκκριτικών πρωτεϊνών και τον ρόλο των πεπτιδίων σήμα στην μετατόπιση.