Φωσφατάσες φωσφοϊνοσιτιδίων και πρωτεϊνες με υποτομείς πρόσδεσης σε φωσφοϊνοσιτίδια του παράσιτου LEISHMANIA: χαρακτηρισμός δύο αντιπροσωπευτικών μορίων και μελέτη του ρόλου τους στον κύκλο ζωής του παρασίτου και στην λοίμωξη του θηλαστικού ξενιστή με το παράσιτο

Abstract

Leishmania parasites cause vector-borne diseases known as Leishmaniases, with L. donovani causing visceral leishmaniasis, the most severe form of the disease. During their biological cycle, Leishmania parasites undergo distinct developmental transitions that involve dramatic changes in cell size and shape, flagellum reassembly, and membrane and cytoskeleton remodeling. Phosphoinositide signaling and metabolism are likely to play central roles in these processes. We identified the LDBPK_220120 gene as the L. donovani ortholog of LmjF.22.0250 from L. major that encodes a Dual Specificity P-Tyr and monophosphorylated [PtdIns(3)P and PtdIns(4)P] PI phosphatase. We named the gene product LDBPK_220120.1 as LdTyrPIP_22 (Leishmania donovani Tyrosine PI Phosphatase). Biochemical and immunofluorescence studies confirmed its expression in several intracellular sites in the cell body of L. donovani promastigotes and amastigotes, and in the flagellum. A temperature and pH shift from 25 °C to 37 °C and from pH 7 to 5.5, induced a pronounced recruitment of LdTyrPIP_22 epitopes to the flagellar pocket and a redistribution around the nucleus. These results suggest possible role(s) for this P-Tyr/PI phosphatase in the regulation of processes initiated or upregulated by this temperature/pH shift that contribute to the parasite’s developmental transition from Metacyclic prompastigotes (MPs) to amastigotes inside the mammalian host macrophages.Sorting nexins (SNXs) are a group of eukaryotic proteins that play crucial roles in intracellular trafficking, endosome dynamics, protein sorting, and autophagy. They contain a PX domain that binds to specific phosphoinositide (PI) phospholipids and have additional structural domains, such as BAR and FERM, that confer diverse functions. Despite their evolutionary conservation, SNXs are poorly studied in protists. Herein, is reported the identification and characterization of the first SNX identified in Leishmania protozoan parasites, named LdSNXi. In silico analysis revealed that LdSNXi belongs to the SNX-BAR subfamily, with a PX domain at its N-terminal half and a BAR domain at its C-terminal half. Biochemical and immunofluorescence studies confirmed its expression and localization in L. donovani promastigotes and axenic amastigotes. Its localization was also studied in transfected human HeLa cells. Sequence and structural analysis revealed high homology between LdSNXi and human SNX2. Investigation of protein-protein interactions predicted LdSNXi putative molecular partners and their functions in Leishmania protists.

Τα παράσιτα Leishmania προκαλούν την ασθένεια της Λεϊσμανίασης, με το είδος Leismania (L.) donovani να προκαλεί τη σοβαρότερη μορφή της νόσου, τη σπλαχνική λεϊσμανίαση. Κατά τη διάρκεια του βιολογικού τους κύκλου, τα παράσιτα Leishmania υφίστανται διακριτές αναπτυξιακές αλλαγές που περιλαμβάνουν δραματικές αλλαγές στο μέγεθος και το σχήμα των κυττάρων, την αναδιαμόρφωση των μαστιγίων και την αναδιαμόρφωση της μεμβράνης και του κυτταροσκελετού. Η σηματοδότηση και ο μεταβολισμός των φωσφοϊνοσιτιδίων, λειτουργικών λιπιδίων στα ευκαρυωτικά κύτταρα, παίζουν πιθανότατα κεντρικούς ρόλους σε αυτές τις διαδικασίες. Στο πλαίσιο αυτής της μελέτης ταυτοποιήσαμε το γονίδιο LDBPK_220120 ως το ορθολόγο στο είδος L. donovani του LmjF.22.0250 από το είδος L. major. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί μια φωσφατάση διπλής ειδικότητας η οποία αποφωσφορυλιώνει κατάλοιπα φωσφοτυροσίνης και τα μονοφωσφορυλιωμένα φωσφοϊνοσιτίδια [PtdIns(3)P και PtdIns(4)P]. Ονομάσαμε το γονιδιακό προϊόν LDBPK_220120.1 LdTyrPIP_22 (Leishmania donovani Tyrosine PI Phosphatase). Βιοχημικές μελέτες και ανοσοφθορισμός επιβεβαίωσαν την έκφραση της συγκεκριμμένης φωσφατάσης σε αρκετές ενδοκυττάριες περιοχές στο κυτταρικό σώμα των προμαστιγωτών και αξενικών αμαστιγωτών L. donovani καθώς και στο μαστίγιο. Αλλαγή της θερμοκρασίας και του pΗ από 25°C σε 37°C και από pΗ 7 σε 5,5, προκάλεσε έντονη “μετακίνηση” επιτόπων της LdTyrPIP_22 στην περιοχή έκφυσης του μαστιγίου και ανακατανομή γύρω από τον πυρήνα. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν πιθανό ρόλο(-ους) αυτής της φωσφατάσης καταλοίπων φωσφοτυροσίνης και φωσφοϊνοσιτιδίων στη ρύθμιση διεργασιών που ξεκινούν ή ρυθμίζονται ενισχυτικά από τη μεταβολή θερμοκρασίας/pH και συμβάλλουν στην αναπτυξιακή μετάβαση από μετακυκλικά προμαστιγωτά (Μetacyclic Promastigotes: MPs) σε αμαστιγωτά εντός των μακροφάγων των θηλαστικών ξενιστών.Οι νεξίνες διαλογής (Sorting Nexins: SNXs) είναι μια ομάδα ευκαρυωτικών πρωτεϊνών που παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ενδοκυττάρια μετακίνηση κυστιδίων, τη δυναμική των ενδοσωμάτων, τη διαλογή πρωτεϊνών και την αυτοφαγία. Στη δομή τους περιέχουν μια περιοχή PX (Phox homology domain) που δεσμεύεται σε συγκεκριμένα φωσφοϊνοσιτίδια και έχουν επιπλέον δομικές περιοχές, όπως το BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) και το FERM (4.1/ezrin/radixin/moesin), που προσδίδουν στις πρωτεΐνες επιπλέον λειτουργίες. Παρά την εξελικτική συντήρησή τους, οι SNXs έχουν μελετηθεί ελάχιστα στα πρώτιστα. Στην παρούσα διατριβή αναφέρουμε την ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό της πρώτης SNX που εντοπίστηκε στα παράσιτα Leishmania την οποία ονομάσαμε LdSNXi. In silico ανάλυση αποκάλυψε ότι η LdSNXi ανήκει στην υποοικογένεια SNX-BAR, με έναν υποτομέα PX στο αμινοτελικό άκρο και μια περιοχή BAR στο καρβοξυτελικό άκρο. Βιοχημικές μελέτες και μικροσκοπία φθορισμού επιβεβαίωσαν την έκφραση και τον εντοπισμό της σε προμαστιγωτά και αξενικά αμαστιγωτά L. donovani. Ο εντοπισμός της επίσης μελετήθηκε σε επιμολυσμένα κύτταρα HeLa. Η ανάλυση της αλληλουχίας και της δομής αποκάλυψαν υψηλή ομολογία μεταξύ της LdSNXi και της ανθρώπινης SNX2. Η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης προέβλεψε πρωτεΐνες υποθετικούς μοριακούς συνοδούς και τις λειτουργίες τους σε παράσιτα Leishmania.