Ετήσιες διακυμάνσεις αιματολογικών παραμέτρων στο ευρωπαϊκό λαβράκι (Dicentrarchus labrax L.) και συσχετισμός τους με τις φυσιολογικές μεταβολές αβιοτικών παραμέτρων, σε εντατική εκτροφή

Abstract

The present research was conducted on a sea bass population intensively farmed in floating marine cages. The aim of the investigation was to investigate whether and how the natural fluctuations of environmental parameters (sea water temperature, dissolved oxygen concentration, sunlight) and the sexual maturity affected the specific growth rate, daily feeding rate, food conversion rate and the levels of hematological and biochemical parameters of European sea bass. In order to achieve this target, the following were evaluated: a) Annual natural fluctuations of seawater temperature, dissolved oxygen concentration, sunlight and salinity, b) Specific growth rate (SGR), daily food intake (FR) and food conversion ratio (FCR) of sea bass, c) Annual changes in plasma total lipids, triglycerides, total cholesterol, total protein and glucose concentration, d) Annual changes in hematocrit, hemoglobin, red blood cells counts, white blood cells counts, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin and mean corpuscular hemoglobin concentration, e) Annual changes in gonadal steroids. Furthermore, fish otoliths were examined to verify age and growth data of the sea bass population. The growth and feeding data of the present study will enable aquaculturalists to improve productivity by adjusting the feeding rate to the real fish demands, taking into account the natural fluctuations of the sunlight and the seawater temperature. The hematological data will enable fish physiologists to establish more precise limits of hematological parameters for the assessment of the condition and health of intensively reared fish. The sea bass examined were reared in marine cages under natural conditions of seawater temperature, dissolved oxygen concentration, sunlight and salinity. During their second year of life (April 1994 - March 1995) the following parameters were investigated: a) Specific growth rate, daily feeding rate and food conversion ratio, b) Hematological and biochemical parameters (hematocrit, hemoglobin, red blood cells counts, white blood cells counts, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration, plasma total lipids, triglycerides, total cholesterol, glucose, total protein, gonadal steroids). Hematological and biochemical parameters were correlated with natural abiotic parameters (seawater temperature, dissolved oxygen concentration, sunlight). Furthermore, fish otoliths were extracted and examined. The lack of females was remarkable. In total among 240 experimental individuals collected, 193 were males and 47 sexually indeterminate. Annual fluctuations of testosterone levels were calculated in males. Furthermore, males were examined to see whether they released sperm after a gently abdominal massage. Testosterone increase and sperm release from October 1994 indicated the first sexual maturity of males. Testosterone concentration in males was determined using a Radioimmunoassay (RIA) method. Sea bass specific growth rate, daily feeding rate and food conversion ratio were higher during the summer and the autumn, when the seawater temperature was high. They showed positive correlation with seawater temperature (SGR v SWT r = 0,87, FR v SWT r = 0,76, FOR v SWT r = 0,80) and sunlight (SGR v SLT r = 0,40, FR v SLT r = 0,92, FOR v SLT r = 0,96). The already known growth rate fluctuations and the age of the population were precisely confirmed after the microscopic examination of the otoliths. Plasma total lipids, triglycerides, total cholesterol and glucose concentrations were higher in summer and autumn 1994 and this fact was attributed to the higher feeding rate and was correlated with the sexual maturity. Triglycerides (r = 0,70) and glucose (r = 0,56) showed a positive correlation with the feeding rate. The high glucose concentration in October 1994 was attributed to the high testosterone level. Cholesterol concentration remained high in the winter 1994-95. Total cholesterol showed negative correlation with daily food intake (r= -0.53) and sunlight (r= -0.57). Total plasma protein concentration showed small fluctuations throughout the year due to the constant composition of the diet provided and was not significantly influenced by the feeding rate. Plasma triglycerides concentration was determined according to the GPO/PAP colorimetric method. Total plasma lipids concentration was determined according to the colorimetric sulfophosphovanilique method. Total plasma cholesterol concentration was determined according to the PAP colorimetric method. Total plasma protein concentration was determined according to the Biuret colorimetric method. Plasma glucose concentration was determined according to the GOD - PAP colorimetric method. Assays for testosterone, total lipids, triglycerides, cholesterol, glucose and total protein determinations were made using diagnostic kits for human analysis. Therefore, where necessary, all the proper modifications were made so that the concentrations measured fel within the linearity range of the kit. Annual fluctuations of hematocrit, hemoglobin, red blood cells and white blood cells counts were attributed to abiotic factors (sea water temperature, dissolved oxygen concentration, sunlight) and reproduction. Mean body weight of sea bass population increased in June 1994 and hemopoiesis increased one month later. Hematocrit, white blood cells and red blood cells counts were high in summer 1994 but they decreased in September 1994 on account of the sunlight decrease. However, they increased again during the reproductive period in the winter. Levels of red blood cells and hematocrit were high in summer 1994 providing the sea bass with high amounts of oxygen. High oxygen demands in summer were attributed to the high growth rate. Mean corpuscular volume did not fluctuate significantly. Hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin and mean corpuscular hemoglobin concentration were higher during the winter. Hemoglobin showed a negative correlation (r = -0,47) with seawater temperature and feeding rate (r = -0,66). Hematocrit (r = -0,50), red blood cells counts (r = - 0,61) and hemoglobin concentration (r = -0,70) showed negative correlation with sunlight. Hemoglobin concentration was determined by spectrophotometry according to the cyanmethemoglobin procedure. Red blood cells and white blood cells were measured with Neubauer hemocytometer. The present research was conducted in a sea bass population intensively farmed in floating marine cages and the following conclusions were made. These conclusions were of two types either new or verification of older ones: A) Conclusions that verified older investigations: 1. Specific growth rate is higher during the summer and autumn months and show negative values at the end of the reproductive cycle. 2. Daily food intake is higher during the summer and autumn months. 3. Triglycerides show positive correlation with seawater temperature, sunlight and feeding rate. 4. The increase of plasma lipids and glucose during summer and autumn is indicative of increased transport of these metabolites to the gonads for energy supply and sperm production. 5. The lack of female sea bass is noticeable in intensive aquaculture. 6. Male sea bass achieve their first sexual maturity during the winter, at the end of their second year of life. The maturity is indicated by an increase in testosterone and sperm release. 7. High testosterone levels at the beginning of the gametogenesis period induce glucose increase. 8. Growth rate fluctuations and age of cage reared sea bass can be verified after the otoliths microscopic examination. B) Conclusions that are formulated for the first time: 1. Food conversion ratio shows positive correlation with seawater temperature and sunlight and for the precise determination of the feeding rate, natural protocols of seawater temperature and sunlight should be taken into account. 2. Otoliths of farmed sea bass can be utilized as references for the establishment of an otolith library. 3. Glucose levels are positively correlated with seawater temperature, sunlight and feeding rate. 4. Total plasma protein concentration show a small fluctuation throughout the year due to the constant diet composition and is not significantly influenced by the feeding rate and the abiotic parameters (seawater temperature, dissolved oxygen concentration, sunlight). 5. Testosterone concentration of male sea bass shows negative correlation with sunlight. 6. Sea bass hemopoiesis is affected by abiotic factors (seawater temperature, dissolved oxygen concentration, sunlight) and reproduction and follows an annual internal cycle. 7. Biomonitoring of cage reared fish populations based on hematological and biochemical indices could provide an innovative and useful addition to the traditional population study approaches. 8. The development of a routine methodology is feasible after the proper modification of the diagnostic clinical kits used for human purposes so that these could be directly used on fish aliquots.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε σε ένα πληθυσμό Ευρωπαϊκού λαβρακιού (Dicentrarchus labrax L.) από εντατικό τύπο εκτροφής σε θαλάσσιους ιχθυοκλωβούς, με σκοπό να διερευνηθεί αν και με ποιο τρόπο οι φυσικές μεταβολές των περιβαλλοντικών παραμέτρων (θερμοκρασία ύδατος, συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, αλατότητα, pH, ηλιοφάνεια) και η γεννητική ωριμότητα επηρεάζουν τον ειδικό αυξητικό ρυθμό, την ημερήσια κατανάλωση τροφής, το συντελεστή εκμετάλλευσης τροφής και τα επίπεδα των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων των ψαριών. Επιπλέον, διερευνήθηκε η δυνατότητα επιβεβαίωσης της ηλικίας των εκτρεφόμενων λαβρακιών καθώς και των μεταβολών στο ρυθμό αύξησής τους ύστερα από την παρατήρηση των ωτολίθων τους. Τα δεδομένα αύξησης και διατροφής της παρούσας διατριβής θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν από τις μονάδες εντατικής εκτροφής. Η ποσότητα της παρεχόμενης τροφής στα ψάρια θα πρέπει να προσαρμόζεται στις πραγματικές ανάγκες τους, λαμβάνοντας υπόψη τις φυσικές μεταβολές της θερμοκρασίας του ύδατος αλλά και της ηλιοφάνειας στην εκάστοτε περιοχή, με απώτερο στόχο την αριστοποίηση της παραγωγικής διαδικασίας. Τα αιματολογικά και βιοχημικά ευρήματα αποσκοπούν στο να συμβάλλουν σε έναν μελλοντικό καθορισμό των φυσιολογικών ορίων διακύμανσης των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων στα ψάρια εντατικής εκτροφής. Τα όρια αυτά θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν προκειμένου να παρακολουθηθεί η φυσιολογική ανάπτυξη και ευρωστία των εκτρεφόμενων ιχθυοπληθυσμών. Τα λαβράκια που χρησιμοποιήθηκαν για τις πειραματικές ανάγκες της παρούσας διατριβής προέρχονταν από εντατικού τύπου εκτροφή σε θαλάσσιους ιχθυοκλωβούς (Ιχθυοκαλλιεργητική Ερύσου Ε. Π. Ε., Νομός Κεφαλονιάς), υπό φυσικές συνθήκες θερμοκρασίας και ηλιοφάνειας. Κατά τη διάρκεια του δεύτερου χρόνου ζωής τους (Απρίλιος 1994 - Μάρτιος 1995): α) Μετρήθηκαν ανά μήνα ο ειδικός αυξητικός ρυθμός, η ημερήσια κατανάλωση τροφής, ο συντελεστής εκμετάλλευσης τροφής και οι αιματολογικές παράμετροι ολικά λιπίδια, τριγλυκερίδια, ολική χοληστερόλη, γλυκόζη, ολικές πρωτεΐνες, αιματοκρίτης, αιμοσφαιρίνη, ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα, μέσος ερυθροκυτταρικός όγκος, μέση πυκνότητα και μέση περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης, β) Συσχετίστηκαν οι μεταβολές των αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων με τις φυσιολογικές μεταβολές των αβιοτικών παραμέτρων (θερμοκρασία ύδατος, συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, ηλιοφάνεια), γ) Παρακολουθήθηκε ενδοκρινολογικούς η γεννητική ωριμότητα του ιχθυοπληθυσμού και δ) Μελετήθηκαν οι ωτόλιθοί τους. Η έλλειψη θηλυκών κατά τη διάρκεια των δειγματοληψιών ήταν εμφανής. Από ένα σύνολο 240 λαβρακιών, που συλλέχτηκαν από τον ιχθυοκλωβό, τα 193 ήταν αρσενικά, ενώ για τα υπόλοιπα δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός του φύλου μακροσκοπικά. Οι συγκεντρώσεις της τεστοστερόνης στο πλάσμα των αρσενικών μετρήθηκαν με ραδιοανοσοβιολογική μέθοδο (RIA). Ο ειδικός αυξητικός ρυθμός (SGR), η ημερήσια κατανάλωση τροφής (FR) και ο συντελεστής εκμετάλλευσης τροφής του ιχθυοπληθυσμού (FCR) ήταν υψηλότερα κατά τους θερμούς θερινούς και φθινοπωρινούς μήνες, σε σχέση με τους χειμερινούς. Εμφάνισαν θετική συσχέτιση με τη θερμοκρασία του ύδατος (SGR v SWT r = 0,87, FR v SWT r = 0,76, FCR v SWT r = 0,80) και την ηλιοφάνεια (FR v SLT r = 0,92, FCR v SLT r = 0,96). Οι μεταβολές του αυξητικού ρυθμού επιβεβαιώθηκαν μέσω της μελέτης των ωτόλιθων των λαβρακιών. H ηλικία των ψαριών, καθορίστηκε μέσω της μελέτης των ωτόλιθων και επιβεβαιώθηκε από το πρωτόκολλο ηλικίας της μονάδας εκτροφής. Οι συγκεντρώσεις των ολικών λιπιδίων, των τριγλυκεριδίων, της ολικής χοληστερόλης και της γλυκόζης ήταν αυξημένες κατά τους θερινούς και φθινοπωρινούς μήνες λόγω της αυξημένης κατανάλωσης τροφής και της μεταφοράς τους στις γονάδες, για να χρησιμοποιηθούν ως ενεργειακή πηγή (λιπίδια, γλυκόζη), για την παραγωγή σπέρματος (λιπίδια), για την παραγωγή γοναδικών στεροειδών και ως συστατικά κυτταρικών μεμβρανών (χοληστερόλη). Τα τριγλυκερίδια (r = 0,70) και γλυκόζη (r = 0,56) εμφάνισαν θετική συσχέτιση με την κατανάλωση τροφής. Η χοληστερόλη διατηρήθηκε σε υψηλό επίπεδο και τους χειμερινούς μήνες και παρουσίασε αρνητική συσχέτιση με την ημερήσια κατανάλωση τροφής (r= -0,53) και την ηλιοφάνεια (r= -0,57). Η αυξημένη συγκέντρωση γλυκόζης κατά τον Οκτώβριο μπορεί να αποδοθεί στην αύξηση παραγωγής τεστοστερόνης. Οι ολικές πρωτεΐνες πλάσματος παρουσίασαν μια μικρή διακύμανση στη συγκέντρωσή τους στη διάρκεια του έτους λόγω του αμετάβλητου ποιοτικά σιτηρεσίου και δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από την κατανάλωση τροφής. Τα ολικά λιπίδια, τα τριγλυκερίδια, η ολική χοληστερόλη, η γλυκόζη και οι ολικές πρωτεΐνες πλάσματος μετρήθηκαν φασματοφωτομετρικά. Για τα ολικά λιπίδια χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος θειοφωσφοβανιλλίνης, για τα τριγλυκερίδια η ενζυμική μέθοδος GPO/PAP, για τη χοληστερόλη η ενζυμική μέθοδος ΡΑΡ, για τη γλυκόζη η ενζυμική μέθοδος GOD-PAP και για τις ολικές πρωτεΐνες η μέθοδος διουρίας. Για τις μετρήσεις της τεστοστερόνης, των ολικών λιπιδίων, των τριγλυκεριδίων, της ολικής χοληστερόλης, της γλυκόζης και των ολικών πρωτεϊνών στο πλάσμα των λαβρακιών, χρησιμοποιήθηκαν διαγνωστικά αντιδραστήρια, τα οποία όμως ήταν παρασκευασμένα για μετρήσεις σε ανθρώπινα δείγματα. Για το λόγο αυτό, όπου ήταν αναγκαίο, έγιναν οι ενδεδειγμένες τροποποιήσεις ώστε οι μετρούμενες συγκεντρώσεις να βρίσκονται εντός των ορίων γραμμικότητας των αντιδραστηρίων. Οι μεταβολές στον αιματοκρίτη, στον αριθμό ερυθροκυττάρων και λευκοκυττάρων και στη συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης του λαβρακιού αποδόθηκαν τόσο σε περιβαλλοντικούς παράγοντες (θερμοκρασία ύδατος, συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, ηλιοφάνεια) όσο και στη διαδικασία της αναπαραγωγής. Τα υψηλά επίπεδα ερυθροκυττάρων και αιματοκρίτη κατά το καλοκαίρι του 1994 βοήθησαν τα λαβράκια να ανταποκριθούν στις αυξημένες απαιτήσεις σε O2 λόγω του υψηλού θερινού αυξητικού ρυθμού. Υψηλότερα επίπεδα ερυθροκυττάρων και αιματοκρίτη παρατηρήθηκαν κατά τους χειμερινούς μήνες, κατά την περίοδο της γεννητικής ωριμότητας. Ο αριθμός ερυθροκυττάρων παρουσίασε αρνητική συσχέτιση με την κατανάλωση τροφής (r = -0,58). Υψηλά επίπεδα λευκοκυττάρων παρατηρήθηκαν κατά τους θερμούς θερινούς μήνες καθώς και κατά τους χειμερινούς μήνες (περίοδος γεννητικής ωριμότητας). Ο μέσος ερυθροκυτταρικός όγκος δεν παρουσίασε σημαντικές μεταβολές στη διάρκεια του έτους. Η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης, η μέση πυκνότητα και η μέση περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης ήταν υψηλότερες κατά τους χειμερινούς μήνες. Η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης εμφάνισε αρνητική συσχέτιση με τη θερμοκρασία του ύδατος (r = -0,47) και την κατανάλωση τροφής (r = -0,66). Ο αιματοκρίτης (r = -0,50), ο αριθμός ερυθροκυττάρων (r = -0,61) και η συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης (r = - 0,70) παρουσίασαν αρνητική συσχέτιση με την ηλιοφάνεια. Η συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης προσδιορίστηκε με τη φασματοφωτομετρική μέθοδο κυανομεθαιμοσφαιρίνης. Η πραγματοποίηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής σε λαβράκια εντατικής εκτροφής οδήγησε στην εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων, που είτε αποτελούν επιβεβαίωση προγενέστερων μελετών είτε διατυπώνονται για πρώτη φορά· έτσι ομαδοποιούνται σε δυο κατηγορίες αντιστοίχως: Α) Συμπεράσματα που επιβεβαιώνουν προγενέστερες μελέτες: 1. Ο ειδικός αυξητικός ρυθμός των εκτρεφόμενων λαβρακιών εμφανίζεται υψηλότερος τους θερμούς θερινούς και φθινοπωρινούς μήνες σε σχέση με τους χειμερινούς, ενώ εμφανίζει αρνητική τιμή στο τέλος της αναπαραγωγικής διαδικασίας. 2. Η ημερήσια κατανάλωση τροφής εμφανίζει υψηλότερη τιμή τους θερμούς θερινούς και φθινοπωρινούς μήνες, σε σχέση με τους χειμερινούς. 3. Η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα των λαβρακιών εκτροφής εμφανίζει θετική συσχέτιση με τη θερμοκρασία του ύδατος, την ηλιοφάνεια και την ημερήσια κατανάλωση τροφής. 4. Οι συγκεντρώσεις των ολικών λιπιδίων και γλυκόζης είναι αυξημένες κατά το καλοκαίρι και το φθινόπωρο εξαιτίας της μεταφορά τους προς τις αναπτυσσόμενες γονάδες, όπου χρησιμοποιούνται, κυρίως, ως ενεργειακή πηγή, αλλά και για την παραγωγή σπέρματος. 5. Στα λαβράκια εντατικής εκτροφής είναι αξιοσημείωτη η σπανιότητα των θηλυκών. 6. Τα αρσενικά λαβράκια ωριμάζουν γεννητικά τη χειμερινή περίοδο, κατά το τέλος του δεύτερου έτους ζωής τους και η γεννητική ωριμότητα χαρακτηρίζεται από αύξηση στη συγκέντρωση της τεστοστερόνης και παραγωγή σπέρματος. 7. Η αυξημένη έκκριση τεστοστερόνης κατά την έναρξη της περιόδου γαμετογένεσης του λαβρακιού προκαλεί αύξηση στα επίπεδα γλυκόζης στο πλάσμα. 8. Η ηλικία των εκτρεφόμενων λαβρακιών, καθώς και οι μεταβολές του αυξητικού ρυθμού τους είναι δυνατό να επιβεβαιωθούν μετά από μελέτη των ωτολίθων τους. Β) Συμπεράσματα που διατυπώνονται για πρώτη φορά: 1. Ο συντελεστής εκμετάλλευσης τροφής των εκτρεφόμενων λαβρακιών παρουσιάζει θετική συσχέτιση με την ηλιοφάνεια και τη θερμοκρασία του ύδατος· τα φυσικά πρωτόκολλα μεταβολής της θερμοκρασίας του ύδατος και της ηλιοφάνειας πρέπει να λαμβάνονται υπόψη για τον καθορισμό της ποσότητας της τροφής, που παρέχεται στα εκτρεφόμενα λαβράκια, με απώτερο στόχο την αριστοποίηση της παραγωγικής διαδικασίας. 2. Οι ωτόλιθοι των λαβρακιών εκτροφής μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρότυπα για τη δημιουργία μιας βιβλιοθήκης ωτόλιθων λαβρακιού. 3. Η συγκέντρωση γλυκόζης στο πλάσμα των εκτρεφόμενων λαβρακιών εμφανίζει θετική συσχέτιση με τη θερμοκρασία του ύδατος, την ηλιοφάνεια και την ημερήσια κατανάλωση τροφής. 4. Η συγκέντρωση των ολικών πρωτεϊνών στο πλάσμα, εξαιτίας της χορήγησης αμετάβλητου ποιοτικά σιτηρεσίου, παρουσιάζει μικρή διακύμανση στη διάρκεια του έτους και δεν επηρεάζεται σημαντικά από τις μεταβολές στις αβιοτικές παραμέτρους (θερμοκρασία ύδατος, συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, ηλιοφάνεια) και την κατανάλωση τροφής. 5. Η συγκέντρωση τεστοστερόνης των αρσενικών λαβρακιών εμφανίζει αρνητική συσχέτιση με την ηλιοφάνεια. 6. Η αιμοποίηση του λαβρακιού επηρεάζεται από παράγοντες περιβαλλοντικούς (θερμοκρασία ύδατος, συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου, ηλιοφάνεια), από τη διαδικασία της αναπαραγωγής και ακολουθεί ενδογενή ετήσιο ρυθμό. 7. Οι αναλύσεις αίματος σε πληθυσμούς εντατικής εκτροφής είναι δυνατό να αποτελέσουν ένα επιπρόσθετο, ριζοσπαστικό εργαλείο για την παρακολούθηση της φυσιολογικής ανάπτυξης και υγιεινής τους, αλλά και ένα χρήσιμο βιολογικό δείκτη εκτίμησης της ποιοτικής κατάστασης του υδάτινου περιβάλλοντος εκτροφής τους. 8. Η εφαρμογή μιας μεθοδολογίας ρουτίνας για τις αναλύσεις αίματος σε εκτρεφόμενα είδη ψαριών είναι δυνατή ύστερα από τις κατάλληλες τροποποιήσεις στα διαγνωστικά αντιδραστήρια, αφού αυτά είναι παρασκευασμένα για αναλύσεις σε ανθρώπινα δείγματα.