Μελέτη της καταπόνησης και ανάπτυξη μη-επεμβατικής μεθόδου προσδιορισμού της ελεύθερης κορτιζόλης στο θαλασσινό νερό σε μεσογειακά είδη ιχθύων, με έμφαση στο λαβράκι, Dicentrarchus labrax

Abstract

Τhe last decade, animal welfare is of increasing concern to scientists, consumers and producers. Although there is not a generally accepted definition of welfare, it refers to an animal’s physical and mental state with regard to its environment. Stress can be an important factor of welfare disturbance and it is considered to be a condition in which homeostasis is threatened or disturbed. Stress is not necessarily detrimental for the organism. On the contrary, the response to stress is considered an adaptive mechanism that allows the fish to cope with harmful or threatening situations. When fish are exposed to severe or persistent stressors and they are not capable of regaining homeostasis, then the responses themselves may become maladaptive and threaten the fish’s health and well-being. The allostasis concept has been introduced recently. Allostasis, i.e. stability through change, is a fundamental process through which organisms actively adjust to both predictable and unpredictable events.Physiological stress responses are divided into primary (endocrine level: release of cortisol and catecholamines), secondary (level of metabolism and osmoregulation) and tertiary (level of the organism). Increased plasma cortisol is a reliable and easily detected indicator but it is influenced by husbandry conditions, capture and bleeding, type of stress (acute or chronic), physical factors and the physiological state of the fish..Recently, research has focused on the development of non-invasive methods for estimating stress response, such as water cortisol determination. Free cortisol release into the water represents a passive “leakage” through the gills, due to concentration differences between plasma and water. There are several advantages of the non-invasive procedure compared to blood sampling: (i) water sampling does not disturb the fish; (ii) repeated samples can be taken from the same population in time-course experiments reducing the numbers of tanks and animals required, and (iii) stress experiments can be carried out on fishes that are too small to be bled. In addition, behavioral and physiological monitoring can be performed at the same time. The disadvantages of the non-invasive procedure are that it effectively integrates the cortisol release of all members of a population and it is likely to depend not only upon the plasma cortisol concentration, but also on the rate of diffusion of cortisol through the gills. Diffusion of cortisol through the gills is influenced by a variety of factors including gill surface area, permeability, branchial blood flow and ventilatory water flow and it may vary with species, fish size and environmental factors, such as water temperature.The overall aim of the present study was to investigate the stress response and to develop and evaluate a non-invasive method for the determination of free cortisol release into seawater in several Mediterranean fish species, with emphasis on the European sea bass, Dicentrarchus labrax.The study is divided in two sections. The first section mainly concerns methodological items and basic experimentation, and in particular the:(i) Development and evaluation of a non-invasive method for the determination of free cortisol released into seawater for European sea bass (Chapter 2),(ii) Determination of the effect of sampling on the stress response of six fish species (European sea bass, gilthead seabream, Sparus aurata, common Pandora, Pagellus erythrinus, sharpsnout seabream, Diplodus puntazzo, dusky grouper, Epinephelus marginatus and meager, Argyrosomus regius) of 4 Mediterranean families (Chapter 3), and(iii) Determination of the species-specificity in the acute stress response of seven Mediterranean fish species (European sea bass, gilthead seabream, common pandora, sharpsnout seabream, dusky grouper, meager and common dentex, Dentex dentex) (Chapter 4).Results showed that the non-invasive method is reliable for the assessment of stress response for European sea bass maintained in sea water, although the cortisol release rate (ng g-1 h-1) was lower than expected based on the high plasma cortisol concentrations observed in this species. In addition, it was shown that there is species-specificity in capture tolerance and that capture with hook and line generally induced a lower stress response. Finally, for the first time in these species, results clearly showed species-specificity of the primary and secondary stress response both in the magnitude and the pattern of changes. Cortisol release rates into the water were lower than those of fresh water species with regard to the plasma cortisol concentrations.The second section of the study is focused on the investigation of significant parameters of the European sea bass stress response and in particular the: (i) Peripheral regulation of cortisol (comparative approach: European sea bass and dusky grouper, species with high and low cortisol stress response, respectively) (Chapter 5),(ii) Consistency of the cortisol stress response: investigation into the presence of high (HR) and low (LR) stress-responsive fish (Chapter 6),(iii) Ontogeny of the cortisol stress response during early development (Chapter 7),(iv) Effect of fish size on the cortisol release rate (Chapter 8), and(v) Effect of sex and sexual maturation in plasma cortisol and cortisol release rate (Chapter 9).Results showed that European sea bass generally presented higher cortisol concentrations in the tissues studied, but only liver and spleen were statistically significantly different compared to the dusky grouper. In regard to the consistency of the stress response, results did not confirm the existence of consistently divergent plasma cortisol and glucose responses in European sea bass exposed to acute stress. Ontogenesis of cortisol in European sea bass under intensive farming conditions displayed a similar pattern to that of other fish species studied so far, but with higher whole-body cortisol concentrations, especially after the stage of flexion (27 Days Post Hatching, DPH). Whole-body cortisol content was decreased during the embryonic development to reach a minimum at hatching and then started to increase due to de novo cortisol synthesis (11 DPH). Stress response was activated at first feeding stage (11 DPH), when the Hypothalamus-Pituitary-Interrenal (HPI) axis became functional, though at a lower extent than subsequent stages. Transport simulation of juvenile European sea bass in two different densities (20 kg m-3 and 50 kg m-3) showed elevated cortisol release rates. Results indicate that there is a difference in cortisol release rate with size, although the two sizes studied had similar plasma cortisol concentrations. Larger individuals presented a 3-fold higher cortisol release rate than smaller fish, in accordance to their body mass difference. Finally, results confirmed that plasma cortisol concentrations are increased in mature individuals of both sexes. In addition, plasma cortisol was higher in males reared isolated from females than in males in the mixed group (1:1 sex ratio), suggesting possible stress due to altered social relationships or due to the absence of female hormones.

Τα τελευταία χρόνια έχει κερδίσει το ενδιαφέρον τόσο της επιστημονικής κοινότητας όσο και των καταναλωτών και παραγωγών η ευημερία των ζώων. Παρόλο που δεν υπάρχει καθολικά αποδεκτός ορισμός της ευημερίας, συνήθως αντιπροσωπεύει τη φυσική και ψυχολογική κατάσταση ενός ζώου σε σχέση με το περιβάλλον του. Η καταπόνηση (stress) μπορεί να αποτελέσει σημαντικό παράγοντα διατάραξης της ευημερίας. Καταπόνηση ονομάζεται κάθε απειλή ή διαταραχή της ομοιόστασης και δεν είναι απαραίτητα επιβλαβής για τον οργανισμό. Αντίθετα, θεωρείται σαν μια μορφή προσαρμοστικής απόκρισης που προάγει την επιβίωση απέναντι σε επιβλαβείς ή απειλητικές καταστάσεις. Όταν όμως τα ψάρια εκτίθενται σε συνεχείς ή χρόνιους παράγοντες καταπόνησης, υποχωρεί η προσαρμοστική αξία της απόκρισης και μπορεί να εμφανιστούν αρνητικές συνέπειες. Τα τελευταία χρόνια κερδίζει έδαφος η ιδέα της αλλόστασης για την εξήγηση της σταθερότητας μέσω της μεταβολής, η οποία είναι μια βασική διαδικασία μέσω της οποίας οι οργανισμοί προσαρμόζονται ενεργά σε προβλεπόμενα και απρόβλεπτα γεγονότα.Η απόκριση στην καταπόνηση διακρίνεται σε πρωτογενή (ενδοκρινικό επίπεδο: έκκριση κορτιζόλης και κατεχολαμινών), δευτερογενή (επίπεδο μεταβολισμού και οσμωρύθμισης) και τριτογενή (επίπεδο συστημάτων και οργανισμού). Η αύξηση της συγκέντρωσης κορτιζόλης του πλάσματος είναι γενικά αξιόπιστος και εύκολα ανιχνεύσιμος δείκτης καταπόνησης, αλλά επηρεάζεται από τις συνθήκες εκτροφής, τη σύλληψη και την αιμοληψία, το είδος της καταπόνησης (οξύ ή χρόνιο) ή από φυσικούς παράγοντες (αναπαραγωγική ωρίμανση, ημερήσιοι, εποχιακοί και ετήσιοι κύκλοι και τροφικό πρότυπο).Πρόσφατα, η έρευνα στο πεδίο της καταπόνησης των εκτρεφομένων ιχθύων έχει στραφεί στην ανάπτυξη μη-επεμβατικών δεικτών καταπόνησης, όπως είναι ο προσδιορισμός της ελεύθερης κορτιζόλης στο νερό της δεξαμενής που περιέχει τα ψάρια. Η απελευθέρωση της ελεύθερης κορτιζόλης στο νερό αποτελεί παθητική «διαρροή» διαμέσου των βραγχίων, λόγω διαφοράς συγκέντρωσης μεταξύ πλάσματος και νερού. Πλεονεκτήματα της μη-επεμβατικής μεθόδου σε σχέση με τον προσδιορισμό της στο αίμα, είναι η μη διατάραξη των ψαριών (δεν απαιτεί αναισθησία, αιμοληψία ή χειρισμούς), η δυνατότητα επαναλαμβανόμενων δειγματοληψιών νερού από τον ίδιο πληθυσμό, η δυνατότητα ταυτόχρονης ηθολογικής και φυσιολογικής παρακολούθησης και η δυνατότητα πειραμάτων καταπόνησης σε ψάρια που είναι πολύ μικρά σε μέγεθος ή/και σπάνια για τη λήψη αίματος. Τα μειονεκτήματα είναι η ενοποίηση της απελευθέρωσης κορτιζόλης όλων των μελών του πληθυσμού και ότι ο ρυθμός απελευθέρωσης κορτιζόλης πιθανότατα εξαρτάται από την επιφάνεια των βραγχίων, τη διαπερατότητα τους και τη βραγχιακή ροή αίματος και νερού, η οποία διαφέρει με το είδος, το μέγεθος του ψαριού και περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η θερμοκρασία του νερού.Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η μελέτη της καταπόνησης και η ανάπτυξη και αξιολόγηση της μη-επεμβατικής μεθόδου προσδιορισμού της ελεύθερης κορτιζόλης στο θαλασσινό νερό για μεσογειακά είδη ψαριών, με έμφαση στο λαβράκι, Dicentrarchus labrax.Η διατριβή χωρίζεται σε δυο ενότητες. Η πρώτη ενότητα αφορά κυρίως στην ανάπτυξη μεθοδολογιών και πιο συγκεκριμένα:(i) στην ανάπτυξη και αξιολόγηση της μεθόδου προσδιορισμού της κορτιζόλης στο θαλασσινό νερό για το λαβράκι (Κεφάλαιο 2),(ii) στη μελέτη της επίδρασης του τρόπου δειγματοληψίας στην απόκριση έξι διαφορετικών ειδών (λαβράκι, τσιπούρα, Sparus aurata, λυθρίνι, Pagellus erythrinus, μυτάκι, Diplodus puntazzo, ροφός, Epinephelus marginatus και κρανιός, Argyrosomus regius, από 4 μεσογειακές οικογένειες (Κεφάλαιο 3), και(iii) στην αξιολόγηση της ειδο-ειδικότητας στην απόκριση καταπόνησης επτά μεσογειακών ειδών (λαβράκι, τσιπούρα, λυθρίνι, μυτάκι, ροφός, κρανιός και συναγρίδα, Dentex dentex) (Κεφάλαιο 4).Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μη-επεμβατική μεθοδολογία, είναι αξιόπιστη για το θαλασσινό νερό και το λαβράκι, παρόλο που ο ρυθμός απελευθέρωσης της κορτιζόλης στο νερό ήταν χαμηλότερος από το αναμενόμενο με βάση τις υψηλές συγκεντρώσεις στο πλάσμα του λαβρακιού. Επίσης, φάνηκε ότι υπάρχει ειδο-ειδικότητα στην ανθεκτικότητα στη σύλληψη και ότι γενικά η σύλληψη με αγκίστρι, προκαλεί λιγότερη καταπόνηση από αυτή με απόχη. Τέλος, τα αποτελέσματα έδειξαν την ύπαρξη σαφούς ειδο-ειδικότητας στην απόκριση σε οξεία καταπόνηση, για πρώτη φορά στα υπό μελέτη είδη, τόσο στην ένταση όσο και στο χρονικό πρότυπο της πρωτογενούς και δευτερογενούς απόκρισης, αλλά και στο ρυθμό απελευθέρωσης της κορτιζόλης στο νερό, τα επίπεδα του οποίου βρέθηκαν χαμηλότερα από αυτά των ειδών γλυκού νερού, σε σχέση με την κορτιζόλη πλάσματος. Η δεύτερη ενότητα εστιάζεται στη διαλεύκανση σημαντικών παραμέτρων της απόκρισης καταπόνησης του λαβρακιού. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν:(i) η περιφερική ρύθμιση κορτιζόλης στο λαβράκι σε σχέση με το ροφό (δυο είδη με υψηλή και χαμηλή, αντίστοιχα, απόκριση κορτιζόλης στην καταπόνηση) (Κεφάλαιο 5),(ii) η διερεύνηση της ύπαρξης ατομικών διαφορών στην απόκριση καταπόνησης (παρουσία ατόμων υψηλής απόκρισης, High Responsive (HR) και χαμηλής απόκρισης, Low Responsive (LR) κορτιζόλης ) (Κεφάλαιο 6),(iii) η οντογένεση της απόκρισης στην καταπόνηση και το πρότυπο των μεταβολών της κορτιζόλης στα πρώτα αναπτυξιακά στάδια (Κεφάλαιο 7),(iv) η επίδραση του μεγέθους των ψαριών στο ρυθμό απελευθέρωσης κορτιζόλης στο νερό (Κεφάλαιο 8), και(v) η επίδραση του φύλου και της αναπαραγωγικής ωρίμανσης, στη συγκέντρωση κορτιζόλης στο πλάσμα και στο ρυθμό απελευθέρωσης της κορτιζόλης στο νερό (Κεφάλαιο 9).Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το λαβράκι παρουσίασε γενικά υψηλότερες τιμές κορτιζόλης από το ροφό στους ιστούς που αναλύθηκαν, αλλά οι διαφορές αυτές ήταν στατιστικά σημαντικές μόνο για το ήπαρ και το σπλήνα. Όσον αφορά στη σταθερότητα της απόκρισης στην καταπόνηση, τα αποτελέσματα δεν επιβεβαίωσαν τη σταθερή παρουσία HR και LR ατόμων στο συγκεκριμένο πληθυσμό λαβρακιού. Η μελέτη της οντογένεσης της κορτιζόλης σε συνθήκες εντατικής εκτροφής, έδειξε ότι το λαβράκι παρουσιάζει παρόμοιο πρότυπο μεταβολών με αυτό άλλων ειδών, αλλά υψηλότερες συγκεντρώσεις κορτιζόλης σώματος και κυρίως μετά το στάδιο της κάμψης της νωτοχορδής (27η ημέρα μετά την εκκόλαψη, Day Post Hatching, DPH). Η κορτιζόλη μειώθηκε κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης μέχρι την εκκόλαψη περίπου και στη συνέχεια άρχισε να αυξάνεται λόγω της έναρξης της ενδογενούς παραγωγής (11 DPH). Η απόκριση στην καταπόνηση ξεκίνησε ήδη από το στάδιο του πρώτου ταΐσματος (11 DPH), όπου και σηματοδοτείται η λειτουργία του υποθαλαμικού – υποφυσιακού – μεσονεφρικού (Hypothalamus – Pituitary – Interrenal, HPI) άξονα, αλλά η ένταση της αυξήθηκε στα μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια. Επίσης, ανώριμα άτομα λαβρακιού, κατά τη διάρκεια προσομοίωσης μεταφοράς για 24 ώρες σε δύο πυκνότητες (20 και 50 kg m-3) παρουσίασαν αυξημένους ρυθμούς απελευθέρωσης κορτιζόλης. Το μέγεθος των ψαριών επηρέασε το ρυθμό απελευθέρωσης κορτιζόλης μετά από καταπόνηση, παρά τις παρόμοιες συγκεντρώσεις κορτιζόλης στο πλάσμα και στα δύο μεγέθη που μελετήθηκαν. Τα μεγαλύτερα άτομα απελευθέρωναν κορτιζόλη με τριπλάσιο ρυθμό από τα μικρότερα, όση ήταν περίπου και η διαφορά των μαζών τους. Τέλος, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις κορτιζόλης πλάσματος στα ώριμα άτομα και των δύο φύλων σε σύγκριση με τα ανώριμα. Η κορτιζόλη πλάσματος των απομονωμένων, από τα θηλυκά, αρσενικών ατόμων ήταν υψηλότερη από αυτή των ανάμικτων αρσενικών (αναλογία φύλου 1:1), υποδεικνύοντας πιθανή καταπόνηση λόγω μεταβολής των κοινωνικών σχέσεων, είτε λόγω αυξημένου ανταγωνισμού, επιθετικότητας και δημιουργίας ιεραρχιών, λόγω και της χαμηλής πυκνότητας που επικρατούσε στη διάρκεια του πειράματος, είτε λόγω της απουσίας των θηλυκών ορμονών.