Σύνδρομο οξείας ισχαιμίας-επαναιμάτωσης των κάτω άκρων και μελέτη της προστατευτικής δράσης της αντιθρομβίνης ΙΙΙ στο ήπαρ: πειραματική μελέτη σε επίμυες

Abstract

INTRODUCTION: Ischaemia of skeletal muscles is followed by a series of metabolic disturbances that depend on the degree and duration of ischaemia. Reperfusion is crucial if a non-reversible damage is to be prevented. On the other hand, reperfusion results in several metabolites being released in the systemic circulation with a potentially deleterious effect. As a result, this could lead to a multiplied increase of intensity and extent of tissue damage. The liver, an anatomical site for metabolism and production of several substances, is one of the remote organs that could be damaged induced by ischaemia and reperfusion of skeletal muscles. Antithrombin III seems to protect tissues during reperfusion after prolonged ischaemia. PURPOSE: The aim of this study was to investigate the possible protective function of Antithrombin III on the harmful effects of free oxygen radicals in liver following ischaemia and reperfusion of the lower limbs with large skeletal muscle mass. METHODS: In this experimental study, we used 70 Wistar male rats, weighing 250-300gr. Sixty animals were submitted to complete ischaemia of the right hind limb and 10 were used as controls. Ischaemia was induced by tourniquet application to the upper thigh region and confirmed by angiography or ultrasonography. The duration of ischaemia was 6 hours. Thirty minutes before the end of ischaemia, the animals were randomised in two groups (A, B). In group A, antithrombin III was given intravenously, whereas in group B placebo (NaCl 0.9%) was given instead. After reperfusion, a further 3 subgroups were formed depending on the duration of reperfusion and timing of the procedure (Α1, Β1: immediately after the end of ischaemia; Α2, Β2: 30 min; Α3, Β3: 4 h). Hepatic tissue specimens were taken from all animals and studied under optical and electron microscopy. These samples were also used for the indirect quantification of free oxygen radicals by measuring malondialdehyde (MDA). Blood samples were also taken from all animals to measure the following: Transaminases (SGOT, SGPT), γ-glutamic aminotransferase (γ-GT), alkaline phosphatase (ALP), white cell count and platelets. After taking blood samples and tissue specimens, animals were killed by the administration of potassium chloride. RESULTS: Comparing group A with B, there was a decrease of MDA in all subgroups. This decrease was statistically significant in 2 and 3, i.e. in 30-min reperfusion (p<0.05) and in 4h (p<0.05). Measurement of the other haematological and biochemical parameters showed a diminishing tendency for SGOT in group A which becomes statistically significant in 4h (p<0.01). Nevertheless, electrone microscopy findings are the one thing that substantially documents the protective function of antithrombin III. Few mitochondria appear oedematous compared with group B, whereas intracellular oedema is clearly milder. Endoplasmic reticulum widening was recognised in a lesser degree and there were no necrosis or extensive damage to nuclei. CONCLUSIONS: This study suggests that antithrombin III administration helps in attenuating the oxidative reaction which is recorded by MDA, and there is also a biochemical improvement. In conclusion, antithrombin III administration prior to blood restoration in an ischaemic muscle seems to exert a protective action to the hepatic manifestations.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Η ισχαιμία των σκελετικών μυών συνοδεύεται από μία σειρά μεταβολικών διαταραχών που εξαρτάται από το βαθμό και το χρόνο ισχαιμίας. Η επαναιμάτωση σε ένα ισχαιμικό μυ είναι ουσιαστική για να αποτρέψει τη μη αναστρέψιμη βλάβη του ιστού. Προσφέρει το απαιτούμενο οξυγόνο που είναι απαραίτητο για τις μεταβολικές διεργασίες, ταυτόχρονα όμως παράγονται διάφορα τοξικά προϊόντα με τοπική και συστηματική βλαπτική επίδραση. Έτσι, η ίδια η επαναιμάτωση, αυτή καθ' εαυτή, μπορεί να οδηγήσει σε πολλαπλάσια αύξηση της έντασης και έκτασης των ιστικών βλαβών, συγκρινόμενη με αυτή της ισχαιμίας. Το ήπαρ, θέση μεταβολισμού και παραγωγής πολλών ουσιών, είναι ένα από τα απομακρυσμένα όργανα στόχος που δυνητικά υφίστανται βλάβη κατά την ισχαιμία και επαναιμάτωση των μυών. Η αντιθρομβίνη ΙΙΙ φαίνεται ότι συμβάλλει στην προστασία των ιστών όταν αυτά επαναιματώνονται μετά από περιόδους ισχαιμίας. ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση της πιθανής προστατευτικής δράσης της αντιθρομβίνης ΙΙΙ (ΑΤ ΙΙΙ) στη βλαπτική επίδραση στο ήπαρ όταν προκαλείται ισχαιμία και επαναιμάτωση των κάτω άκρων που διαθέτουν μεγάλες μυϊκές μάζες. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ: Στην πειραματική μας μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 70 άρρενες επίμυες της φυλής Wistar βάρους 250-300γρ. Οι 60 από αυτούς υποβλήθηκαν σε πλήρη ισχαιμία του δεξιού οπισθίου άκρου και οι 10 χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα μαρτύρων. Η πρόκληση ισχαιμίας πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή ίσχαιμης περίδεσης στο ριζομήριο του επίμυος και επιβεβαιώθηκε με αγγειογραφικό έλεγχο ή υπερήχους. Η διάρκεια ισχαιμίας ήταν έξι (6) ώρες. Τριάντα (30) λεπτά πριν την άρση της ισχαιμίας οι επίμυες τυχαιοποιήθηκαν σε δυο (2) ομάδες (Α,Β). Στην ομάδα Α χορηγήθηκε ενδοφλεβίως ΑΤ ΙΙΙ ενώ στην ομάδα Β εικονικό φάρμακο (διάλυμα NaCl 0.9%). Μετά την άρση της ισχαιμίας έγινε επιπλέον διάκριση σε τρείς υποομάδες ανάλογα με τη διάρκεια της επαναιμάτωσης και τη διενέργεια της επέμβασης. (Α1,Β1: αμέσως μετά την άρση, Α2,Β2: 30 λεπτά, Α3,Β3: 4 ώρες.) Από όλα τα πειραματόζωα λήφθηκαν ιστοτεμάχια ήπατος τα οποία μελετήθηκαν με οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διερχόμενης δέσμης και χρησιμοποιήθηκαν για τον έμμεσο προσδιορισμό των ελευθέρων ριζών οξυγόνου με τη μέτρηση της μαλονικής διαλδεΰδης (MDA). Επίσης σε όλους τους επίμυες διενεργήθηκε αιμοληψία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των εξής παραγόντων: Τρανσαμινάσες (SGOT, SGPT), γ-γλουταμική αμινοτρανσφεράση (γ- GT), αλκαλική φωσφατάση (ALP),λευκά αιμοσφαίρια και αιμοπετάλια. Μετά την αιμοληψία και τη λήψη βιοψιών τα πειραματόζωα θανατώθηκαν με τη χορήγηση χλωριούχου καλίου (KCl). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Κατά τη σύγκριση της ομάδας Α με την ομάδα Β τεκμηριώθηκε ελάττωση της MDA σε όλες τις υπο-ομάδες. Η ελάττωση αυτή αποδείχθηκε στατιστικώς σημαντική στην 2 και 3, δηλ. στην επαναιμάτωση των 30 λεπτών (p<0.05) και των 4 ωρών (p<0.05). Η παρακολούθηση των άλλων αιματολογικών και βιοχημικών παραμέτρων ανέδειξε πτωτική τάση στις τιμές της SGOT στην ομάδα Α η οποία γίνεται στατιστικώς σημαντική στις 4 ώρες (p<0.01). Από την παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ελάχιστα μιτοχόνδρια της ομάδας Α εμφανίζονται οιδηματικά σε σχέση με την ομάδα Β, ενώ το ενδοκυτταρικό οίδημα ήταν σαφώς πιο ήπιο. Η διεύρυνση του ενδοπλασματικού δικτύου αναγνωρίστηκε σε μικρότερο βαθμό, ενώ δεν διαπιστώθηκαν νεκρώσεις ή μεγάλες αλλοιώσεις στους πυρήνες. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η χορήγηση ΑΤ ΙΙΙ φαίνεται ότι βοηθάει στην ελάττωση της οξειδωτικής καταπόνησης όπως αυτή καταγράφεται από την MDA, ενώ παρατηρείται και κάποια βιοχημική βελτίωση από τη χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ. Εκείνο όμως που τεκμηριώνει σημαντικά την προστατευτική δράση της ΑΤ ΙΙΙ είναι τα ευρήματα στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Συμπερασματικά μπορούμε να υποστηρίξουμε ότι η χορήγηση της ΑΤ ΙΙΙ πριν από την αποκατάσταση της αιμάτωσης σε ισχαιμικούς μυς ασκεί προστατευτική επίδραση στις εκδηλώσεις από το ήπαρ.