STUDIES ON RAT BRAIN CYTOSOLIC FATTY ACYL COENZYME A THIOESTERASE

Abstract

RAT BRAIN CYTOSOLIC ACYL COA THIOESTERASE (EC 3.1.2.2) WAS PURIFIED 3,500 - FOLD TO APPARENT HOMOGENEITY USING HEAT TREATMENT AND AMMONIUM SULFATE FRACTIONATION, FOLLOWED BY ANION EXCHANGE, HYDROPHOBIC INTERACTION AND HYDROXYAPATITE CHROMATOGRAPHY. THE PURIFIED ENZYME REMAINED STABLE ONLY IN THE PRESENCE OF ETHYLENE GLYCOL (30% V/V). ON SDS-PAGE THE PURIFIED ENZYME SHOWED A SINGLE BAND OF41 KDA. HOWEVER, ON SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY THE MIGRATION RATE OF THE ENZYME CORRESPONDED WITH AN APPARENT MOLECULAR MASS OF 148 KDA, INDICATING THATTHE NATIVE ENZYME MAY BE A TETRAMER. THE ENZYME CATALYZED THE HYDROLYSIS OF FATTY ACYL COAS FROM SIX TO TWENTY CARBON ATOMS LONG, HAVING THE HIGHEST ACTIVITY FOR LAUROYL (12:0) COA. FOR THE PURIFIED ENZYME, THE KM FOR PALMITOYL COA WAS 5.8 ΜM AND THE VMAX WAS 1300 ΜMOL/MIN/MG PROTEIN. THE ENZYME WAS INHIBITED BY BOVINE SERUM ALBUMIN, VARIOUS DETERGENTS, LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE AND PALMITOYL CARNITINE. AMONG THE SULFHYDRYL AGENTS, ONLY P-HYDROXYMERCURIBENZOATE INHIBITED THE ENZYME. THE ENZYME WAS ALSO INACTIVATED BY TREATMENT WITH DIETHYL PYROCARBONATE (10 MM), AN ACTIVE CENTER HISTIDINE-REACTING AGENT, BUT NOT BY PHENYLMETHYLSULFONYLFLUORIDE (10MM), A SERINE ESTERASE INHIBITOR. THE PURIFIED ENZYME DID NOT POSSESS ANY O-ESTER HYDROLASE, LYSOPHOSPHOLIPASE, TRANSACYLASE OR ACYLTRANSFERASE ACTIVITY. (ABSTRACT TRUNCATED)

Η ΚΥΤΟΣΟΛΙΚΗ ΘΕΙΟΕΣΤΕΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΚΥΛΟ COA (E.C.3.1.2.2) ΚΑΘΑΡΙΣΤΗΚΕ ΑΠΟ ΤΟΝ ΕΓΚΕΦΑΛΟ ΤΟΥ ΑΡΟΥΡΑΙΟΥ 3.500-ΦΟΡΕΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΜΕΤΟΥΣΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕ ΘΕΡΜΑΝΣΗ, ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΜΕ ΘΕΙΙΚΟ ΑΜΜΩΝΙΟ, ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ ΑΝΙΟΝΤΩΝ (ANION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY), ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΔΡΟΦΟΒΙΚΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ (HYDROPHOBICINTERACTION CHROMATOGRAPHY) ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΔΡΟΞΥΑΠΑΤΙΤΗ (HYDROXYAPATITE CHROMATOGRAPHY). ΤΟ ΚΑΘΑΡΙΣΜΕΝΟ ΕΝΖΥΜΟ ΠΑΡΕΜΕΙΝΕ ΣΤΑΘΕΡΟ ΜΟΝΟ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΙΘΥΛΙΝΙΚΗΣ ΓΛΥΚΟΛΗΣ (ETHYLENE GLUCOL, 30% V/V). ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΗΚΤΗΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣΠΑΡΟΥΣΙΑ ΔΩΔΕΚΑΘΕΙΙΚΟΥ ΝΑΤΡΙΟΥ (SDS-POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS) ΚΑΤΕΔΕΙΞΕ ΠΩΣ ΤΟ ΚΑΘΑΡΟ ΕΝΖΥΜΟ ΕΙΧΕ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ 41 KDA. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΕΚΛΟΥΣΗΣ (SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY) ΕΔΕΙΞΕ ΠΩΣ Η ΘΕΙΟΕΣΤΕΡΑΣΗ ΕΙΧΕ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ 148KDA, ΥΠΟΔΗΛΩΝΟΝΤΑΣ ΠΩΣ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΣΤΗ ΦΥΣΙΚΗ ΤΟΥ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΕΙΝΑΙ ΤΕΤΡΑΜΕΡΕΣ. ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΚΑΤΑΛΥΕΙ ΤΗΝ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΤΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΑΚΥΛΟ COA ΑΠΟ 6 ΕΩΣ 20 ΑΤΟΜΑ ΑΝΘΡΑΚΑ ΚΑΙ ΔΕΙΧΝΕΙ ΤΗΝ ΜΕΓΙΣΤΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΜΕ ΤΟ ΔΩΔΕΚΑΝΟΥΛΟ COA. Η ΣΤΑΘΕΡΑ MICHAELIS (KM) ΜΕ ΤΟ ΠΑΛΜΙΤΟΥΛΟ COA ΣΑΝ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΕΙΝΑΙ 5.8 ΜΜ ΚΑΙ Η ΜΕΓΙΣΤΗ ΤΑΧΥΤΗΤΑ (VMAX) 1.300 ΜMOL/MIN-MG ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ. Η ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ ΤΟΥ ΟΡΟΥ ΤΟΥ ΒΟΕΙΔΟΥΣ (BOVINE SERUM ALBUMIN), ΔΙΑΦΟΡΑ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΑ, Η ΛΥΣΟΦΩΣΦΑΤΙΔΥΛΟΧΟΛΙΝΗ ΚΑΙ Η ΠΑΛΜΙΤΟΥΛΟΚΑΡΝΙΤΙΝΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΑΝ ΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ. ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΑΠΩΛΕΣΕ ΤΗΝ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΜΕ ΤΟ ΔΙΑΙΘΥΛΟΠΥΡΟΚΑΡΒΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΠΟΥ ΑΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΕΙ ΤΗΝ ΙΣΤΙΔΙΝΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ, ΕΝΩ ΤΟ ΦΑΙΝΥΛΟΜΕΘΥΛΟΣΟΥΛΦΟΝΟΦΘΟΡΙΔΙΟ ΠΟΥ ΑΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΕΙ ΤΗΝ ΣΕΡΙΝΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ, ΔΕΝ ΕΙΧΕ ΚΑΜΜΙΑ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΗΝ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ. (ΠΕΡΙΚΟΠΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗΣ)