Αξιολόγηση κινδύνου έκθεσης του γενικού πληθυσμού σε πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες (PAHs) μέσω προσδιορισμού της συγκέντρωσής τους σε τρόφιμα, με βελτιστοποιημένη τεχνική GC-MS/MS

Abstract

The extensive release and distribution of chemical pollutants in the atmospheric air, in seawater, surface and underground water and soil along with their accumulation in the living organisms, results in their trophic transfer through the food chain along with the consequent prolonged exposure of many species, including humans. After entering the body, these pollutants may express their toxic action and cause significant adverse effects on health, such as developmental problems, damages to the reproductive, immune and endocrine systems, induction of carcinogenesis etc.Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are a large group of organic compounds. Some of them have proved to be toxic, harmful pollutants and are considered as a "threat" to humans and other living organisms. Sixteen of them are designated as High Priority Pollutants by the US-Environmental Protection Agency (EPA), while the European Food Safety Authority (EFSA) and the other European authorities have identified 15 PAHs as mutagenic, toxic and carcinogenic and benzo[g,h,i]perylene as mutagenic and toxic (15+1 PAH).Their presence in food items and the dietary exposure to PAH is evaluated by various Organizations. The European Union recommends the continuous monitoring of levels of 15+1 PAHs in food, while the use of the sum of 4 PAHs (benz[a]anthracene, chrysene, benzo[a]pyrene, benzo[b]fluoroanthene) is proposed as an indicator of the presence of carcinogenic PAHs in food. The EU has established maximum limits for the presence of benzo[a]pyrene, the most dangerous PAH and the sum of 4 PAHs in certain food categories, for the protection of public health. A large number of studies has been conducted in various countries, in order to estimate the exposure of general population on PAHs, through food consumption.In this context, the present Doctoral Thesis aims at the monitoring of PAHs’ concentration levels in food, in order to estimate the overall intake through food consumption for assessing the potential exposure risk of the Greek population. For this purpose, a highly selective and sensitive analytical method of isotopic dilution using labeled internal standards, in combination with the use of an optimized Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (GC-MS/MS) technique was developed and validated, for the determination of PAHs at the background level. The method is in compliance with the requirements of the relevant European Commission Regulations and was found suitable for the monitoring of PAHs levels in food, even in trace concentrations, a necessary action for the protection of public health. Twenty six PAHs were determined, including the EU 15+1 PAHs, the EPA 16 PAHs, as well as benzo[e]pyrene and perylene.The method was initially applied to 51 samples of bivalve molluscs, which are considered as environmental indicators. Sampling of the molluscs was conducted in Central Macedonia Region, from aquacultures in the Thermaikos and Strymonikos Gulf, in three sampling periods. PAHs were detected in all mussel samples, the Low Molecular Weight PAHs being the predominant in all samples. The average concentrations for the total of 26 PAHs ranged from 1.37 to 25.59 μg kg-1 wet weight, while none of the samples exceeded the established EU limit for PAHs levels in bivalve molluscs. Mussels from winter sampling period had the highest average concentration levels for the sum of PAHs, while no significant difference in the concentration levels was observed between the three sampling sites.Subsequently, concentration levels of PAHs were determined in dietary food samples, collected with the help of volunteers and according to the Duplicate diet/portion study protocol method. This method was selected, since the determination of the pollutants is conducted in the final meal that someone consumes, taking into account the burden of PAHs contributed by cooking and maintenance techniques. The sum of the 26 PAHs in the analyzed samples ranged from 4.43 to 15.11 μg kg-1, while levels of benzo[a]pyrene and the sum of 4 PAHs did not exceed the maximum limits established for all food groups, in any of the samples. The diagnostic ratios and distribution patterns of PAHs in the samples, showed that PAHs’ profile in dietary food samples is directly related to the type of participants’ diet.For the general population of Greece, the mean upper daily intake of 26 PAHs was estimated at 7.16 μg day-1 and the exposure at 101.47 ng kg-1 body weight day-1, of the 4 PAHs at 0.25 μg d-1 and 3.46 ng kg-1 b.w. d-1 and of benzo[a]pyrene at 0.05 μg d-1 and 0.63 ng kg-1 b.w. d-1, respectively. The daily dietary exposure for male participants was higher than that of women, while the exposure was directly related to the type and amount of food consumed. Additionally, the dietary exposure of the Greek population was calculated based on the national nutritional consumption data and the concentrations of PAHs in various European food items, reported in the EFSA’s Report of 2008. In this approach, the mean upper daily exposure was estimated at 18,83 ng kg-1 b.w. d-1 for the sum of 4 PAHs and at 3.51 ng kg-1 b.w. d-1 for benzo[a]pyrene, with the corresponding values obtained from the Duplicate Diet approach fluctuating at lower levels.The Duplicate Diet method was found suitable for the estimation of dietary exposure to PAHs, despite the possible slight underestimation of the result. On the contrary, the method based on consumption and concentration data, resulted in high level values and overestimation of the exposure.The calculated Margins of Exposure (MOE) did not indicate a possible risk to PAHs from food consumption, for the general Greek population. The calculated dietary exposure seemed to be in lower levels compared to those determined for the population of other countries, a fact that is attributed to the limited environmental pollution, the type of food that is consumed, the cooking practices, but also to the sensitive and selective analytical methodology that was used.

H εκτεταμένη απελευθέρωση και διασπορά των χημικών ρύπων στην ατμόσφαιρα, στα επιφανειακά, υπόγεια και θαλάσσια ύδατα, στο έδαφος και το υπέδαφος και η συσσώρευσή τους στους ζωντανούς οργανισμούς, έχει ως αποτέλεσμα την εισαγωγή τους στην τροφική αλυσίδα με την επακόλουθη παρατεταμένη έκθεση πολλών ειδών, μεταξύ των οποίων και ο άνθρωπος. Οι ρύποι αυτοί, όταν εισέρχονται στους οργανισμούς, ακόμη και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις, ενδέχεται να εκφράσουν την τοξική τους δράση και να προκαλέσουν σημαντικές αρνητικές επιδράσεις στην υγεία, όπως αναπτυξιακά προβλήματα, βλάβες στο αναπαραγωγικό, ανοσοποιητικό και ενδοκρινικό σύστημα, καρκινογένεση κ.α. Οι Πολυκυκλικοί Αρωματικοί Υδρογονάνθρακες-ΠΑΥ (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons-PAHs) είναι μια ομάδα οργανικών ενώσεων, εκ των οποίων ορισμένοι θεωρούνται ως τοξικοί και επιβλαβείς ρύποι και αποτελούν «απειλή» για την υγεία του ανθρώπου και των υπόλοιπων ζωντανών οργανισμών. Από το σύνολό τους, 16 ΠΑΥ συγκαταλέγονται ως ρύποι προτεραιότητας από την Environmental Protection Agency (EPA) των ΗΠΑ, ενώ σύμφωνα με την European Food Safety Authority (EFSA) και τις υπόλοιπες ευρωπαϊκές αρχές 15 από αυτούς παρουσιάζουν μεταλλαξιογόνο, τοξική και καρκινογόνο δράση και ένας ακόμη, το βενζο[g,h,i]περυλένιο μεταλλαξιογόνο και τοξική (15+1 ΠΑΥ). Η παρουσία στα τρόφιμα και η διατροφική έκθεση σε ΠΑΥ έχουν αξιολογηθεί από διάφορους Οργανισμούς. Η Ευρωπαϊκή Ένωση συστήνει τη συνεχή παρακολούθηση των επιπέδων των 15+1 ΠΑΥ στα τρόφιμα, ενώ έχει προταθεί η χρήση του αθροίσματος 4 ΠΑΥ (βενζ[a]ανθρακένιο, χρυσένιο, βενζο[a]πυρένιο, βενζο[b]φλουορανθένιο), ως δείκτη παρουσίας των καρκινογόνων ΠΑΥ στα τρόφιμα. Για την προστασία της ανθρώπινης υγείας, η Ε.Ε. έχει θεσπίσει μέγιστα επιτρεπτά όρια παρουσίας του βενζο[a]πυρενίου, του πλέον επικίνδυνου ΠΑΥ και του αθροίσματος των 4 ΠΑΥ σε ορισμένες κατηγορίες τροφίμων, ενώ υπάρχει μεγάλος αριθμός μελετών για τη διατροφική έκθεση σε ΠΑΥ του πληθυσμού διαφόρων χωρών.Στο πλαίσιο αυτό, η παρούσα Διδακτορική Διατριβή έχει ως στόχο την παρακολούθηση των επιπέδων των ΠΑΥ στα τρόφιμα, ώστε να εκτιμηθεί η συνολική πρόσληψη μέσω της κατανάλωσης τροφής και να αξιολογηθεί ο πιθανός κίνδυνος έκθεσης σε αυτή την ομάδα ρύπων για τον ελληνικό πληθυσμό. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε κατάλληλη εξειδικευμένη και ευαίσθητη αναλυτική μέθοδος ισοτοπικής αραίωσης με χρήση επισημασμένων εσωτερικών προτύπων, σε συνδυασμό με βελτιστοποιημένη τεχνική Αέριας Χρωματογραφίας-Φασματομετρίας Μαζών σε σειρά (Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry- GC-MS/MS), για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων των ΠΑΥ σε επίπεδο υποβάθρου. Η μέθοδος πληροί τις απαιτήσεις των σχετικών Ευρωπαϊκών Kανονισμών και είναι κατάλληλη για την παρακολούθηση των επιπέδων των ΠΑΥ στα τρόφιμα, ακόμη και σε ίχνη, κάτι που κρίνεται απαραίτητο για την προστασία της δημόσιας υγείας. Στο σύνολό τους προσδιορίστηκαν 26 ΠΑΥ, συμπεριλαμβανομένων των 15+1 ΠΑΥ της Ε.Ε., των 16 ΠΑΥ της EPA καθώς και το βενζο[e]πυρένιο και το περυλένιο. Η μέθοδος αρχικά εφαρμόστηκε σε 51 δείγματα δίθυρων μαλακίων, τα οποία μπορούν να θεωρηθούν ως περιβαλλοντικοί δείκτες. Τα δείγματα προήλθαν από την Περιφέρεια Κεντρικής Μακεδονίας και συγκεκριμένα από υδατοκαλλιέργειες του Θερμαϊκού και Στρυμονικού κόλπου, συλλεγμένα σε τρεις δειγματοληπτικές περιόδους. Ανιχνεύθηκαν ΠΑΥ σε όλα τα δείγματα μυδιών, με τους ΠΑΥ μικρού μοριακού βάρους να είναι οι κυρίαρχοι σε όλα τα δείγματα. Οι μέσες συγκεντρώσεις του συνολου των 26 ΠΑΥ στα μύδια κυμαίνονταν από 1,37 έως 25,59 μg kg-1 νωπού βάρους, ενώ κανένα από τα δείγματα που αναλύθηκαν δεν υπερέβη το θεσμοθετημένο όριο της Ε.Ε. για τα επίπεδα των ΠΑΥ στα δίθυρα μαλάκια. Τα μύδια που συλλέχθηκαν κατά τη χειμερινή περίοδο είχαν τα υψηλότερα επίπεδα συγκέντρωσης για το άθροισμα των ΠΑΥ, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα των συγκεντρώσεων μεταξύ των τοποθεσιών δειγματοληψίας. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των ΠΑΥ σε δείγματα γευμάτων, που συλλέχθηκαν με τη βοήθεια εθελοντών και σύμφωνα με τη μέθοδο εκτίμησης διατροφικής έκθεσης της Εις Διπλούν Δίαιτας (Duplicate diet/portion study). Η συγκεκριμένη μέθοδος επιλέχθηκε έναντι άλλων, μιας και η διερεύνηση των επιπέδων των ρύπων γίνεται στο τελικό γεύμα που καταναλώνει κάποιος, λαμβάνοντας υπόψη την επιβάρυνση σε ΠΑΥ από το μαγείρεμα και τις τεχνικές συντήρησης. Το άθροισμα των συγκεντρώσεων και των 26 ΠΑΥ που προσδιορίσθηκαν στα δείγματα είχε εύρος τιμών μεταξύ 4,43 και 15,11 μg kg-1, ενώ η συγκέντρωση του βενζο[a]πυρενίου και το άθροισμα των συγκεντρώσεων των 4 ΠΑΥ, σε όλα τα δείγματα, δεν ξεπέρασαν κανένα από τα μέγιστα επιτρεπτά επίπεδα παρουσίας οποιασδήποτε ομάδας τροφίμων. Από το είδος της παρουσίας των ΠΑΥ στα τρόφιμα, φάνηκε πως το προφίλ συγκεντρώσεων ΠΑΥ σχετίζεται άμεσα με το είδος της διατροφής των συμμετεχόντων. Για τον γενικό πληθυσμό της Ελλάδας, η μέση ανώτερη ημερήσια πρόσληψη σε 26 ΠΑΥ υπολογίστηκε στα 7,16 μg ημέρα-1 και η έκθεση στα 101,47 ng kg-1 σωματικού βάρους ημέρα-1, σε 4 ΠΑΥ στα 0,25 μg ημ-1 και 3,46 ng kg-1 σ.β. ημ-1 και σε βενζο[a]πυρένιο στα 0,05 μg ημ-1 και 0,63 ng kg-1 σ.β. ημ-1 αντιστοίχως. Η ημερήσια έκθεση για τους άνδρες συμμετέχοντες ήταν υψηλότερη από αυτήν των γυναικών, ενώ η συνολική έκθεση σχετίστηκε άμεσα με το είδος και την ποσότητα της τροφής που καταναλώνει κάποιος. Επιπρόσθετα, η διατροφική έκθεση του ελληνικού πληθυσμού υπολογίσθηκε με βάση τα υπάρχοντα διατροφικά δεδομένα κατανάλωσης της χώρα μας και τις συγκεντρώσεις της Έκθεσης της EFSA του 2008, για τους ΠΑΥ στα ευρωπαϊκά τρόφιμα. Η μέση ανώτερη ημερήσια έκθεση εκτιμήθηκε στα 18,83 ng kg-1 σ.β. ημ-1 για το σύνολο των 4 ΠΑΥ και στα 3,51 ng kg-1 σ.β. ημ-1 για το βενζο[a]πυρένιο, με τις αντίστοιχες τιμές που προέκυψαν από τη μέθοδο της Εις Διπλούν Δίαιτας να κυμαίνονται σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα.Η μέθοδος Εις Διπλούν Δίαιτας φάνηκε να είναι καταληλλότερη για την εκτίμηση της διατροφικής έκθεσης σε ΠΑΥ, παρά την ενδεχόμενη μικρή υποεκτίμηση στο αποτέλεσμα. Αντίθετα, η μέθοδος που βασίστηκε στα δεδομένα κατανάλωσης και συγκεντρώσεων είχε ως αποτέλεσμα υψηλές τιμές επιπέδων και υπερεκτίμηση της έκθεσης. Τα περιθώρια ασφαλούς έκθεσης (Margins of Exposure-MOE) που υπολογίσθηκαν δεν έδειξαν να υπάρχει κίνδυνος για τον γενικό ελληνικό πληθυσμό από τη διατροφική έκθεση σε ΠΑΥ. Μάλιστα, σε πολλές περιπτώσεις φάνηκε να είναι μικρότερη από τις αντίστοιχες άλλων χωρών, γεγονός που αποδίδεται στην περιορισμένη περιβαλλοντική ρύπανση, το είδος των τροφιμών που καταναλώνονται, τις πρακτικές μαγειρέματος, αλλά και στην αναλυτική μεθοδολογία η οποία χρησιμοποιήθηκε.