blaNDM Gram αρνητικά βακτήρια σε ανθρώπους και ζώα στην Κεντρική Ελλάδα

Abstract

Antimicrobial resistance has emerged as one of the major public health problems recorded in the 21st century, hindering the effective treatment of infections caused primarily caused by multidrug-resistant Gram-negative bacteria that no longer exhibit sensitivity to antibiotics.In this dissertation, four species of Gram-negative bacteria (E.coli, K.pneumoniae, P.aeruginosa, and A.baumannii) with resistance to carbapenems were studied. These bacteria were collected between the years 2017-2023 and mainly isolated from patients at the University General Hospital of Larissa. The first stage of the study involved the isolation of resistant strains and the detection of the most common resistance mechanisms observed in Greece (blaKPC, blaNDM, blaVIM and blaOXA-48). The second stage included the selection of blaNDM(+) bacteria and the characterization of the genetic environment of the blaNDM gene through Whole Genome Sequencing. Finally, a comparison of the results with available literature was conducted. The aim was to investigate the spread of the blaNDM gene in various Gram-negative bacteria isolated from samples of humans and animals in Thessaly during the period 2017-2023.Out of 756 animal samples, only one strain of E.coli (0.1%) with resistance to carbapenems isolated, while 270 microorganisms with carbapenem resistance were examined from human samples. Detection of resistance genes revealed the presence of four genes (blaKPC, blaNDM, blaVIM, and blaOXA-48) in K. pneumoniae strains and three genes (blaKPC, blaNDM, blaVIM) in E. coli strains, each in various combinations. In P. aeruginosa strains, two genes (blaNDM, blaVIM) were identified, and in A. baumannii strains, one gene (blaNDM) was found. Among the 70 blaNDM (+) strains identified in the genotypic analysis, 34 were selected for further analysis, including 11 E. coli (1 of animal origin and 10 of human origin), 9 A. baumannii, 9 P. aeruginosa, and 5 K. pneumoniae strains. Specifically, the animal E. coli strain was found to belong to clone ST361 and carried the blaNDM-5 gene in a genetic structure similar to the previously described plasmid p52148. Among human samples, E. coli strains were found to belong to various clones (ST744, SST998, ST224, ST410, ST4380, ST46, ST683, ST12), with the blaNDM-1 gene identified in three genetic structures similar to previously characterized plasmids (pS-3002cz, pB3002cz, pEc19397-131). K. pneumoniae strains were found to belong to three different clones (ST11, ST231, New ST), with the blaNDM-1 gene detected in genetic structures similar to those of the E. coli strains studied (pS-3002cz, pB3002cz). P. aeruginosa strains were found to belong to clone ST308, and the blaNDM-1 gene was located on the chromosome in the integrative element ICETn43716385. Finally, A. baumannii strains were found to belong to four different clones (ST2, ST85, ST160, and ST2493), with the blaNDM-1 gene identified in two different chromosome-located structures in previously characterized transpositional elements (Tn125, Tn7382). It is noteworthy that the detection of the blaNDM-5 gene in an E. coli strain and the blaNDM-1 gene in E. coli and P. aeruginosa strains is reported for the first time in Greece, and simultaneously, it is the first extensive study of blaNDM (+) A. baumannii strains. The spread of specific multidrug-resistant pathogenic clones and the transfer of resistance genes, both between bacteria of the same species and between bacteria of different genus, isolated in the fields of health, veterinary medicine, and the environment, create an emerging threat to human health services worldwide.

Η αντιμικροβιακή αντοχή έχει αναδειχθεί ως ένα από τα κυριότερα προβλήματα της δημόσιας υγείας που καταγράφονται τον 21ο αιώνα καθώς εμποδίζει την αποτελεσματική θεραπεία λοιμώξεων που προκαλούνται κυρίως από πολυανθεκτικά Gram-αρνητικά βακτήρια, τα οποία δεν εμφανίζουν πλέον καμία ευαισθησία σε αντιβιοτικά. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν 4 είδη Gram αρνητικών βακτηρίων (E.coli, K.pneumoniae, P.aeruginosa και A.baumannii) με αντοχή στις καρβαπενέμες, τα οποία συλλέχθηκαν κατά τα έτη 2017-2023 και απομονώθηκαν κυρίως από ασθενείς του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Λάρισας. Πρώτο στάδιο της μελέτης αποτέλεσε η απομόνωση ανθεκτικών στελεχών και η ανίχνευση των συχνότερων μηχανισμών αντοχής που εμφανίζονται στην Ελλάδα (blaKPC, blaNDM, blaVIM και blaOXA-48). Δεύτερο στάδιο ήταν η επιλογή των blaNDM (+) βακτηρίων και ο χαρακτηρισμός του γενετικού περιβάλλοντος του γονιδίου blaNDM με αλληλούχιση ολικού γονιδιώματος. Τέλος, πραγματοποιήθηκε σύγκριση των αποτελεσμάτων με την διαθέσιμη βιβλιογραφία. Ο στόχος ήταν η διερεύνηση της διασποράς του γονιδίου blaNDM σε διάφορα Gram-αρνητικά βακτηρίδια τα οποία απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα ανθρώπων και ζώων κατά την περίοδο 2017-2023 στην Θεσσαλία.Από τα 756 δείγματα ζώων που μελετήθηκαν, αναπτύχθηκε μόνο ένα στέλεχος E.coli (0,1%) με αντοχή σε καρβαπενέμες, ενώ από τα ανθρώπινα δείγματα μελετήθηκαν 270 μικροοργανισμοί με αντοχή σε καρβαπενέμες. Ο έλεγχος ανίχνευσης γονιδίων αντοχής έδειξε την παρουσία τεσσάρων γονιδίων (blaKPC, blaNDM, blaVIM και blaOXA-48) στα στελέχη K.pneumoniae και τριών γονιδίων (blaKPC, blaNDM, blaVIM) στα στελέχη E.coli σε διάφορους συνδυασμούς, ενώ σε στελέχη P.aeruginosa εντοπίστηκαν δύο γονίδια (blaNDM, blaVIM) και σε στελέχη A.baumannii ένα γονίδιο (blaNDM). Από τα 70 blaNDM (+) στελέχη που προέκυψαν κατά τον γονοτυπικό έλεγχο, τα 34 (11 E.coli -1 ζωικής προέλευσης και 10 ανθρώπινης προέλευσης, 9 A.baumannii, 9 P.aeruginosa και 5 K.pneumoniae) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Συγκεκριμένα το ζωικό στέλεχος Ε. coli βρέθηκε να ανήκει στον κλώνο ST361 και να φέρει το blaNDM-5 γονίδιο σε γενετική δομή όμοια με αυτή του πλασμιδίου p52148 που είχε περιγραφεί στο παρελθόν. Από τα ανθρώπινα δείγματα, τα στελέχη E.coli βρέθηκε ότι ανήκουν σε διάφορους κλώνους (ST744, SST998, ST224, ST410, ST4380, ST46, ST683, ST12) ενώ το blaNDM-1 εντοπίστηκε σε τρεις γενετικές δομές όμοιες με προηγούμενα χαρακτηρισμένα πλασμίδια (pS-3002cz, pB3002cz, pEc19397-131). Τα στελέχη K.pneumoniae βρέθηκε ότι ανήκουν σε τρεις διαφορετικούς κλώνους (ST11, ST231, Νέο ST) ενώ το γονίδιο blaNDM-1 εντοπίσθηκε σε γενετικές δομές όμοιες με αυτές των στελεχών E.coli της μελέτης (pS-3002cz, pB3002cz). Τα στελέχη P.aeruginosa βρέθηκε ότι ανήκουν στον κλώνο ST308 και το γονίδιο blaNDM-1 βρέθηκε στο χρωμόσωμα πάνω στο συζευκτικό στοιχείο ICETn43716385. Τέλος, τα στελέχη A.baumannii βρέθηκε ότι ανήκουν σε 4 διαφορετικούς κλώνους (ST2, ST85, ST160 και ST2493), ενώ το γονίδιο blaNDM-1 εντοπίσθηκε σε 2 διαφορετικές δομές τοποθετημένες στο χρωμόσωμα σε ήδη χαρακτηρισμένα μεταθετά στοιχεία (Tn125, Tn7382). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η ανίχνευση του γονιδίου blaNDM-5 σε στέλεχος E.coli και blaNDM-1 σε στελέχη E.coli και P.aeruginosa αναφέρεται για πρώτη φορά στην Ελλάδα, ενώ ταυτόχρονα είναι η πρώτη εκτεταμένη μελέτη blaNDM(+) στελεχών A.baumannii. Η διασπορά συγκεκριμένων πολυανθεκτικών παθογόνων κλώνων και η μεταφορά γονιδίων αντοχής τόσο μεταξύ βακτηρίων του ίδιου είδους όσο και μεταξύ διαφορετικών γενών που απομονώνονται στον τομέα της υγείας και της κτηνιατρικής δημιουργεί μία αναδυόμενη απειλή για τις υπηρεσίες Υγείας του ανθρώπου σε παγκόσμιο επίπεδο.