Επίδραση του μειωμένου επιπέδου διατροφής σε διαφορετικά στάδια κατά την κύηση στα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των απογόνων στο πρόβατο

Abstract

A number of epidemiological and experimental data support the fetal programming hypothesis, which implies that a stimulus or insult acting during a sensitive period of uterine life program the development of fetal tissues and exert organizational effects that persist throughout life. Maternal undernutrition has been suggested as a major factor of fetal programming. The present study was designed to evaluate the effects of maternal undernutrition during two different periods of gestation on reproductive function of both male and female offspring, on. For the purpose of the experiment 36 ewes (Ovies aries) of Chios breed were used that were randomly allocated to three treatments of similar body weight, body score and number of previous pregnancies. Control group (C, n=12), fed 100% of the recommended metabolizable energy (ME) and crude protein (CP) requirements for the whole of gestational period, nutrient restricted group 1 (R1, n=7), offered 50% of the control nutrient allowance during the first 30 days of pregnancy and 100% for the rest of gestation and nutrient restricted group 2 (R2, n=7), fed to 100% of the recommended demands until 30 day of gestation, 50% of the control nutrient allowance from day 31 to day 100 of pregnancy and to 100% for the rest of gestation. Only twin-bearing ewes were used so treatments groups were as follow: C=8, R1=7, R2=5. Blood samples were collected from day 40 of gestation until parturition for determination of cortisol, insulin, thyroid hormones, progesterone and glucose concentrations. Body weight was recorded weekly. After delivery the respective treatments of offspring were as follow: C: male n=7, female n=6, R1: male n=7, female n=7 and R2: male n=5, female n=4. At three different ages (2, 5.5 and 10 months) lambs were injected with 1.5 pg ovine GnRH/Kg body weight to evaluate hypothalamic-pituitary-gonadal function. Blood samples were collected at 0 min before and at 15, 30, 60, 120 and 180 min after the GnRH challenge for determination of gonadotrophins concentration. From the age of five months blood samples were collected twice a week for the measurement of plasma testosterone and progesterone levels to define the age of puberty on male and female offspring, respectively. Male lambs were injected with hCG at the age of 7.5 and 9.5 months in order to evaluate testicular function as defined by testosterone secretion after the challenge. At the age of 10 months female lambs were subjected to estrus synchronization and blood samples were collected at 3 hours intervals for the next 72 hours for detection of gonadotrophins levels. At the end of the experimental period (10 months) lambs were euthanised and testes and ovaries were dissected out, weighed and examined macroscopically. The number as well as the diameter of visible follicles and corpora lutea were recorded. The one ovary and testes sample were kept for histological analysis. Results from pregnant ewes showed that undernutrition during the first month of pregnancy caused a significant increase in cortisol concentration. In contrast, undernutrition from day 31st to 100th caused a significant reduction in thyroid hormones and insulin concentrations during undernutrition. As it was expected, body weight of R2 group was reduced during undernutrition and was maintained reduced until parturition. Results from both male and female offspring revealed that maternal undernutrition did not influence the age of puberty as well as body weight at puberty, pointing at the importance of critical body weight for onset of puberty. Testosterone response to hCG challenge did not differ between male lambs at any age examined. Gonadotrophins profile after estrus synchronisation in female lambs was similar among groups as far as it concerns the time of preovulatory surge as well as the magnitude of this surge. Gonadotrophins response to GnRH challenge was the same for all groups at 2 and 5.5 months of age, of both sexes. However, at the age of 10 months FSH response was found to be significantly higher in female lambs of R1 group, whereas at the same age both FSH and LH responses were found to be higher in male lambs of R2 group. Both testes’ and ovaries’ weight were not influenced by in utero nutrition. After eosin-hematoxilyn staining of testes sections, a lower number of Sertoli cells were observed in seminiferus tubules in R2 group. In the same group the area of seminiferus epithelium was significantly smaller. After TUNEL staining a higher proportion of Sertoli cells with apoptotic nucleus was found in R2 group. However, the absolute number and the proportion of Sertoli cells that express the proliferative protein Ki67 did not differ between groups. Macroscopic examination of ovaries showed a higher number of small follicles (2-3mm diameter) in R1 group, whereas a lower number of corpora lutea with diameter 8-11mm and not even one with diameter 12-16mm was found in R2 group. Histological examination of ovaries did not reveal any differences between groups on the number of apoptotic granulosa cells of graafian follicles. However, significantly lower number of granulosa cells expressed the proliferative protein Ki67, in both nutrient restricted groups. In conclusion, the present study revealed that maternal undernutrition may program alterations on reproductive system function of both male and female offspring. These alterations are immediate to the gonadal development and no through alterations on GnRH-LH/FSH axis regulation. Gonadal function was differentially influenced according to the period of gestation that undernutrition was imposed. These results confirm the theory of critical stage of development of fetal tissue, organ or physiological system, that an insult may program alterations on their development and function. So, maternal undernutrition during development can unfavorably influence reproductive function of offspring of both sexes with severe consequences on animal production.

Τα τελευταία χρόνια όλο και περισσότερο κερδίζει έδαφος η άποψη ότι η ποιότητα του εμβρυϊκού περιβάλλοντος μπορεί να επηρεάσει καθοριστικά το φαινότυπο του ενηλίκου. Εκτός από τις επιδράσεις στην υγεία, ο εμβρυϊκός προγραμματισμός μπορεί να επηρεάσει την αναπαραγωγική ικανότητα, αλλά και την ανάπτυξη των ζώων μετά τη γέννηση. Η διατροφή της μητέρας αποτελεί έναν από τους βασικότερους πυροδοτικούς παράγοντες εμβρυϊκού προγραμματισμού. Η συγκεκριμένη πειραματική μελέτη είχε σκοπό να διερευνήσει την επίδραση του μητρικού υποσιτισμού σε δύο διαφορετικά στάδια της κύησης στα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των απογόνων, στο πρόβατο. Για τη διεξαγωγή του πειράματος χρησιμοποιήθηκαν αρχικά 36 προβατίνες φυλής Χίου, οι οποίες χωρίστηκαν σε τρεις ομοιόμορφες ομάδες ως προς το σωματικό βάρος, τη σωματική κατάσταση και τον αριθμό των προηγούμενων τοκετών. Στην πρώτη ομάδα του μάρτυρα (Μ) (Ν=12), χορηγήθηκε σιτηρέσιο το οποίο κάλυπτε το 100% των αναγκών σε ενέργεια και αζωτούχες ουσίες σε όλη τη διάρκεια της κυοφορίας. Στην ομάδα III (Ν=12) χορηγήθηκε από την ημέρα της οχείας (ημέρα 0) μέχρι την 30η ημέρα κυοφορίας σιτηρέσιο διαμορφωμένο να καλύπτει το 50% των αναγκών σε ενέργεια και αζωτούχες ουσίες, ενώ από την 31η ημέρα της κύησης έως τον τοκετό χορηγήθηκε σιτηρέσιο που κάλυπτε το 100% των αναγκών των ζώων. Στην ομάδα Π2 (Ν=12) μέχρι την 30η ημέρα το χορηγούμενο σιτηρέσιο κάλυπτε το 100% των αναγκών των ζώων, από την 31η έως την 100η το σιτηρέσιο κάλυπτε το 50% των αναγκών, ενώ από την 101η και μέχρι τον τοκετό το χορηγούμενο σιτηρέσιο ήταν το ίδιο με εκείνο του μάρτυρα. Μόνο οι προβατίνες που κυοφορούσαν δύο έμβρυα ελήφθησαν υπ' όψιν στην πειραματική διαδικασία οπότε οι επεμβάσεις διαμορφώθηκαν ως εξής: Μ=8, 111=7, Π2=5. Δείγματα αίματος ελήφθησαν από την 40η ημέρα μέχρι τον τοκετό κάθε 10 ημέρες στα οποία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της κορτιζόλης, της ινσουλίνης, των θυρεοειδικών ορμονών, της προγεστερόνης και της γλυκόζης. Το σωματικό βάρος των προβατινών καταγραφόταν σε εβδομαδιαία βάση. Μετά τον τοκετό προέκυψαν τρεις ομάδες αμνών, αντίστοιχες των ομάδων των μητέρων από τις οποίες προήλθαν, δηλαδή ο Μάρτυρας (αρσενικά n=7, θηλυκά n=6), η επέμβαση Π1 (αρσενικά π=7, θηλυκά n=7) και η επέμβαση Π2 (αρσενικά n=5, θηλυκά π=4). Στους απογόνους και σε τρεις διαφορετικές ηλικίες των 2, 5,5 και 10 μηνών έγινε δυναμική δοκιμασία διέγερσης της υπόφυσης με την εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών (GnRH) για την εκτίμηση της δραστηριότητας του άξονα υποθάλαμος-υπόφυση-γονάδες, ο οποίος ρυθμίζει και ελέγχει την αναπαραγωγική λειτουργία. Δείγματα αίματος ελήφθησαν στους χρόνους 0 και 15, 30, 60, 120 και 180 λεπτά ως προς τη χορήγηση στα οποία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ωοθυλακιοτρόπου (FSH) και ωχρινοποιητικής ορμόνης (LH) και υπολογίστηκε το εμβαδόν της καμπύλης απάντησης (area under the curve). Από την ηλικία των 5 μηνών ελήφθησαν δείγματα αίματος δις εβδομαδιαίως στα οποία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της τεστοστερόνης και της προγεστερόνης για να διαπιστωθεί η ηλικία ενήβωσης των αρσενικών και θηλυκών αμνών, αντίστοιχα. Στους αρσενικούς αμνούς έγινε στην ηλικία των 7,5 και 9,5 μηνών χορήγηση hCG με σκοπό να διερευνηθεί η λειτουργία των όρχεων με μέτρηση της έκκρισης τεστοστερόνης. Στους θηλυκούς αμνούς μετά την ενήβωση πραγματοποιήθηκε συγχρονισμός του οίστρου και μετρήθηκαν τα επίπεδα των γοναδοτροπινών ανά 3 ώρες για τις επόμενες 70 ώρες από το συγχρονισμό. Στο τέλος του πειράματος, διάρκειας 10 μηνών, τα ζώα θυσιάστηκαν και αφού ζυγίστηκαν οι γονάδες και των δύο φύλων οι ωοθήκες εξετάσθηκαν μακροσκοπικώς και μετρήθηκε ο αριθμός και η διάμετρος των ορατών ωοθυλακίων και των ωχρών σωματίων. Τέλος, έγινε ιστολογική παρατήρηση των όρχεων και των ωοθηκών. Από την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων στις έγκυες προβατίνες διαπιστώθηκε ότι ο υποσιτισμός τον πρώτο μήνα της κυοφορίας (Π1) προκάλεσε αύξηση της έκκρισης κορτιζόλης μέχρι την 90η ημέρα της κυοφορίας, χωρίς ωστόσο να επηρεαστούν τα επίπεδα των υπολοίπων ορμονών και της γλυκόζης. Αντίθετα, ο υποσιτισμός από την 31η έως την 100η ημέρα της κυοφορίας προκάλεσε μείωση των θυρεοειδικών ορμονών και της ινσουλίνης κατά τη διάρκεια του υποσιτισμού. Το σωματικό βάρος των προβατινών που εφαρμόστηκε ο παρατεταμένος υποσιτισμός (112) μειώθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια του υποσιτισμού και διατηρήθηκε χαμηλότερο σε σχέση με το μάρτυρα μέχρι τον τοκετό. Στους απογόνους διαπιστώθηκε ότι ο μητρικός υποσιτισμός δεν επηρέασε τόσο την ηλικία ενήβωσης, όσο και το σωματικό βάρος ενήβωσης, υπογραμμίζοντας τη σημασία του “κρίσιμου” σωματικού βάρους για την είσοδο των νεαρών ζώων στην ήβη. Στους αρσενικούς απογόνους η απάντηση της τεστοστερόνης στη διέγερση των όρχεων με την hCG δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές μεταξύ των διατροφικών επεμβάσεων και στις δύο ηλικίες. Το πρότυπο των γοναδοτροπινών μετά το συγχρονισμό του οίστρου στους θηλυκούς αμνούς παρουσιάστηκε το ίδιο τόσο όσον αφορά το χρόνο της προ-ωοθυλακιορρηκτικής αιχμής τους όσο και το μέγεθος της. Η απάντηση των γοναδοτροπινών στη δυναμική δοκιμασία διέγερσης της υπόφυσης με την GnRH εμφανίστηκε ίδια μεταξύ των επεμβάσεων στις ηλικίες των 2 και 5,5 μηνών, τόσο στους θηλυκούς, όσο και στους αρσενικούς απογόνους. Ωστόσο, στην ηλικία των 10 μηνών η απάντηση της FSH παρουσιάστηκε σημαντικά υψηλότερη στους θηλυκούς αμνούς της επέμβασης Π1, ενώ στην ίδια ηλικία η απάντηση της FSH και της LH εμφανίστηκε υψηλότερη στους αρσενικούς αμνούς της επέμβασης Π2. Τόσο το βάρος των όρχεων, όσο και το βάρος των ωοθηκών δεν επηρεάστηκε από τον μητρικό υποσιτισμό. Ο αριθμός των κυττάρων Sertoli βρέθηκε μικρότερος στους αμνούς, οποίων οι μητέρες υποσιτίστηκαν το διάστημα 31η-100η ημέρα της κυοφορίας (Π2). Επιπλέον, στα ίδια ζώα η διάμετρος των σπερματικών σωληνάριων και το εμβαδόν του σπερματικού επιθηλίου βρέθηκαν σημαντικά μικρότερα σε σχέση με εκείνα του μάρτυρα. Το ποσοστό των κυττάρων Sertoli που εμφάνισαν απόπτωση βρέθηκε μεγαλύτερο στα ζώα της ομάδας Π2. Ο απόλυτος αριθμός και το ποσοστό των KÌ67 ανοσοθετικών κυττάρων δεν παρουσίασε διαφορές μεταξύ των επεμβάσεων. Στατιστικά μεγαλύτερος αριθμός ωοθυλακίων μικρής διαμέτρου (2-3mm) παρατηρήθηκε στην επέμβαση Π1 σε σχέση με το μάρτυρα, ενώ στην επέμβαση Π2 μικρότερος αριθμός ωχρών σωματίων διαμέτρου 8-11mm σε σχέση με τον μάρτυρα και καθόλου ωχρά σωμάτια διαμέτρου 12-16mm. Κατά την ιστολογική παρατήρηση διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός των κοκκωδών κυττάρων των ώριμων ωοθυλακίων που παρουσίασαν απόπτωση ήταν ίδιος σε όλες τις επεμβάσεις, ωστόσο, ο αριθμός των Ki67 ανοσοθετικών κυττάρων παρουσιάστηκε σημαντικά χαμηλότερος στα ωοθυλάκια και των δύο ομάδων, οι μητέρες των οποίων υποσιτίστηκαν κατά τη διάρκεια της κυοφορίας. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι ο μητρικός υποσιτισμός μπορεί να προγραμματίσει αλλαγές στη λειτουργία του αναπαραγωγικού συστήματος των απογόνων. Οι επιδράσεις της διατροφής της μητέρας φαίνεται ότι είναι άμεσες στην ανάπτυξη των γονάδων και όχι μέσω της λειτουργίας του άξονα GnRH-LH/FSH. Επίσης, οι επιδράσεις στις γονάδες εμφανίστηκαν διαφορετικές ανάλογα με το στάδιο της εμβρυϊκής ανάπτυξης που εφαρμόστηκε ο υποσιτισμός επιβεβαιώνοντας τη θεωρία της ύπαρξης ενός “κρίσιμου σταδίου ανάπτυξης” του κάθε ιστού ή οργάνου ή φυσιολογικού συστήματος κατά το οποίο οποιοσδήποτε δυσμενής παράγοντας μπορεί να μεταβάλλει και να προγραμματίσει αλλαγές την ανάπτυξη και λειτουργία τους. Τέλος, διαπιστώνεται ότι ο μητρικός υποσιτισμός κατά τη διάρκεια της κυοφορίας αποτελεί ένα σημαντικό δυσμενή παράγοντα της αναπαραγωγικής λειτουργίας των απογόνων και για τους λόγους αυτούς επιβάλλεται η ορθή κάλυψη των αναγκών των εγκύων ζώων ακόμα και στα αρχικά στάδια της κυοφορίας για την εξασφάλιση της βέλτιστης εμβρυϊκής ανάπτυξης και την προαγωγή της ανάπτυξης μετά τη γέννηση και την αποφυγή αναπαραγωγικών προβλημάτων κατά την ενήλικο ζωή.