Long non-coding RNAs in reproduction and immunity of Aedes mosquitoes and prospects for their use in pest control

Abstract

Long non-coding RNAs (lncRNAs) constitute a type of RNA molecules that emerged during the last decades as important regulators of cellular and metabolic processes. Through their interaction with the genomic DNA, other RNA transcripts or proteins, they can modulate vital biological pathways of eukaryotic organisms. Several studies in insect models like D. melanogaster and B. mori have revealed the role of lncRNAs in important processes like development, reproduction, and immunity. However, limited re-search had been conducted, up to now, to elucidate the functional roles of lncRNAs in disease vectors, like mosquitoes.The present thesis aimed to fill this gap by investigating the features and functions of lncRNAs in two major Aedes mosquitoes: Ae. albopictus and Ae. aegypti. These two species are the main vectors of several arboviruses, like Zika, dengue, chikungunya, yellow fever that have been responsible for multiple disease outbreaks throughout the world. The goal was to unravel the role of specific lncRNAs in three biological systems that have great potential for mosquito control: reproduction, immunity, and development. A similar pipeline was applied for the detection of lncRNAs in each system. First, a comprehensive analysis of genomic and transcriptomic data was conducted to unravel lncRNAs that were differentially expressed in Ae. albopictus or Ae. aegypti under conditions, related to reproduction, immunity, or development. Then, a shortlist of lncRNAs was generated, their expression profiles were validated by qPCR, and gene expression was inhibited through RNAi-mediated silencing. RNAi was triggered through microinjection of dsRNA in adult mosquitoes. The phenotypic effect of lncRNA silencing was assessed to determine their potential role in the studied pathways.Reproductive analysis of Ae. albopictus focused on the elucidation of the role of ovary-specific lncRNAs that were enriched after a blood-meal. From several targeted one (Norma3) was highlighted due to its pronounced effect on fecundity and fertility. Silencing of Norma3 provoked an intensive reduction of oviposition (43%) and hatching rates (53%), along with other defected phenotypes, such as retarded ovarian growth and defective embryonic development.Immune analysis of Ae. aegypti focused on the investigation of the influence of lncRNAs that were differentially expressed upon infection with Zika virus, in immunity and reproduction. Three lncRNAs (Zinc1, Zinc2, Zinc22) had an impact on immunity, as their silencing enhanced immune response and reduced significantly viral intensity. Moreover, targeting of two lncRNAs (Zinc22, Zinc9) affected fecundity and fertility of Ae. aegypti indicating their potential role in trade-offs.Developmental analysis of Ae. albopictus relied on the detection of larval-specific genes that could af-fect larval molting or its metamorphosis to pupae. Various genes that were enriched in larvae were de-tected and an RNAi pipeline was developed. Instead of injecting dsRNA, a methodology based on feeding of larvae with dsRNA-expressing E. coli bacteria was preferred, to reduce fitness cost. Results from these assays indicated that bacterial feeding was an insufficient method to trigger RNAi response, contrary to what is stated in published research articles. In addition to the identification of specific lncRNAs that influence reproduction and immunity of Aedes spp. our computational study confirmed the high species-specificity of lncRNAs that has already been re-ported in other species. LncRNAs of Ae. albopictus presented extremely high species-specificity as 7,827 out of the 7,900 annotated lncRNAs (99%) did not share sequence homology with other insect species. The respective number of species-specific lncRNAs of Ae. aegypti was 3,6403 out of the 4,709 annotated genes (77.4%). Overall, the present study introduced species-specific lncRNAs that have a great potential for pest management approaches, especially Norma3 and Zinc22, two lncRNAs that modulate fecundity and fertility of female Ae. albopictus and Ae. aegypti respectively. Species-specificity is a crucial matter for insecticide development, due to the serious off-targeting side effects on beneficial insects, including pollinators and natural predators. Species-specificity along with high efficiency are the ultimate goals when developing pest control approaches. The high species-specificity of lncRNAs in combination with their functional significance render them ideal candidates as molecular targets of novel pesticides.

Τα μακρά μη-κωδικοποιητικά RNAs (lncRNAs) αποτελούν έναν τύπο μορίων RNA που αναδείχθηκαν τις τελευταίες δεκαετίες ως σημαντικοί ρυθμιστές της κυτταρικής λειτουργίας. Η αλληλεπίδραση τους με το γονιδιωματικό DNA, άλλα RNA μετάγραφα ή πρωτεΐνες, έχει αποδειχτεί πως μπορεί να είναι καθοριστική στη διατήρηση ζωτικών λειτουργιών στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Αρκετές μελέτες σε εντόμα, οργανισμούς μοντέλα, όπως η φρουτόμυγα D. melanogaster και ο σκόρος B. mori έχουν αποκαλύψει το ρόλο των lncRNAs σε σημαντικές διαδικασίες όπως η ανάπτυξη, η αναπαραγωγή και η ανοσία. Από την άλλη οι πληροφορίες για το ρόλο και τις λειτουργίες των lncRNAs σε έντομα-φορείς ασθενειών, όπως τα κουνούπια είναι περιορισμένες.Η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο να καλύψει αυτό το κενό διερευνώντας τα χαρακτηριστικά και τις λειτουργίες των lncRNAs στα δύο σημαντικότερα κουνούπια του γένους Aedes: τα Ae. albopictus και Ae. aegypti. Αυτά τα δύο είδη είναι οι κύριοι φορείς διαφόρων ιών, όπως ο Zika, ο δάγκειος πυρετός, ο chikungunya και ο κίτρινος πυρετός. Η αντιμετώπιση των παραπάνω ιών αποτελεί κυρίαρχο ζήτημα καθώς ευθύνονται για πολλά κρούσματα ασθενειών και επιδημίες σε όλο τον κόσμο. Σκοπός της διατριβής ήταν να διαλευκανθεί ο ρόλος συγκεκριμένων lncRNAs σε τρία βιολογικά συστήματα που έχουν ιδιαίτερες προοπτικές για την ανάπτυξη νέων μεθό-δων ελέγχου των κουνουπιών: το αναπαραγωγικό σύστημα, το ανοσοποιητικό και την ανάπτυξη των προνυμφών. Για την ανίχνευση των lncRNAs σε κάθε σύστημα ακολουθήθηκε μία παρόμοια μεθοδολογία. Αρχικά, διεξήχθη μια εκτενής ανάλυση γονιδιωματικών και μεταγραφομικών δεδομένων για τον χαρακτηρισμό διαφορικά εκφρασμένων lncRNAs των κουνουπιών σε συνθήκες που σχετίζονται με την αναπαραγωγή, την ανοσία ή την ανάπτυξη των προνυμφών. Στη συνέχεια, το προφίλ έκφρασης των επιλεγμένων lncRNAs επικυρώθηκε μέσω ποσοτικής Real-Time PCR και η έκφραση των γονιδίων στοχεύθηκε μέσω RNAi μεθοδολογιών. Η ενεργοποίηση του RNAi πραγματοποιήθηκε μέσω της μικροέγχυσης dsRNA σε ενήλικα κουνούπια. Η φαινοτυπική επίδραση της αποσιώπησής των lncRNAs αξιολογήθηκε για να προσδιοριστεί ο πιθανός ρόλος τους στα υπό μελέτη συστήματα.Αρχικά, η αναπαραγωγική ανάλυση του Ae. albopictus επικεντρώθηκε στη διαλεύκανση του ρόλου lncRNA των οποίων η έκφραση επαγόταν στις ωοθήκες έπειτα από ένα γεύμα αίματος. Η στόχευση έξι lncRNAs οδήγησε τα κουνούπια σε μειωμένη ωοαπόθεση. Εν συνεχεία, τα πειράματα εστιάσαν στο ρόλο ενός (Norma3) λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών του και της έντονης επίδρασής που είχε η απουσία του στην ωοαπόθεση και την εκκόλαψη των αυγών. Η αποσιώπηση του Norma3 προκάλεσε σημαντικότατη μείωση των ποσοστών ωοπόθεσης (47%) και εκκόλαψης των αυγών (53%). Παρατηρήθηκαν παράλληλα και άλλοι ελλαττωματικοί φαινότυποι, όπως καθυστερημένη ανάπτυξη των ωοθηκών και προβληματική εμβρυική ανάπτυξη. Η ανάλυση του ρόλου lncRNAs στην ανοσολογική απόκριση του Ae. aegypti εστίασε στη σχέση του με τον ιό Zika. Εντοπίστηκαν διαφορικά εκφρασμένα lncRNAs έπειτα από μόλυνση με τον Zika και εξετά-στηκε η επίδραση τους στην εξάπλωση του ιού καθώς και στην επιρροή που έχει η απουσία τους για το ανοσοποιητικό σύστημα. Τρία lncRNAs (Zinc1, Zinc2, Zinc22) εμφάνισαν σημαντικό αντίκτυπο στην ανοσία, καθώς η αποσιώπησή τους ενίσχυσε την ανοσολογική απόκριση και μείωσε σημαντικά την ένταση του ιού. Επιπλέον, η στόχευση δύο lncRNAs (Zinc22, Zinc9) επηρέασε τη γονιμότητα και την εκκόλαψη των αυγών του, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο τους στo αντιστάθμισμα αναπαραγωγής ανο-σίας (reproduction-immunity trade off).Η μελέτη αναπτυξιακών γονιδίων του Ae. albopictus στηρίχθηκε στην lncRNAs με αποκλειστική έκφραση στις προνύμφες γονιδίων, που θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη μεταμόρφωση τους σε νύμγες. Αρκετά γονίδια εμφανίστηκαν υπερεκφρασμένα στις προνύμφες και εν συνεχεία επιχειρήθηκε η σίγηση τους. Αντί της μικροέγχυσης προκρίθηκε η χορήγηση στις προνύμφες διαγονιδιακών στλεχών E. coli με ικανότητα παραγωγής δίκλωνου RNA. Τα αποτελέσματα αυτών των δοκιμών έδειξαν ότι η σίτιση με βακτήρια ήταν ανεπαρκής μέθοδος για την ενεργοποίηση της απόκρισης RNAi. Τα ευρήματα αυτά έρχονται σε αντίθεση με δημοσιευμένες μελέτες που υποστηρίζουν πως οι μεθοδολογίες τους προκάλεσαν επαρκή σίγηση.Εκτός από την ταυτοποίηση συγκεκριμένων lncRNAs που επηρεάζουν την αναπαραγωγή και την ανοσία των κουνουπιών Aedes albopictus και Aedes aegypti, η βιοπληροφορική μας μελέτη επιβεβαίωσε την υψηλή εξειδίκευση των lncRNAs και στα Aedes, όπως ήδη έχει αναφερθεί και σε άλλη είδη. άλλα είδη. Τα lncRNAs του Ae. albopictus παρουσίασαν εξαιρετικά υψηλή ειδο-ειδικότητα, καθώς 7.827 από τα 7.900 χαρακτηρισμένα lncRNAs (99%) δεν εμφάνιζαν καμία ομολογία της αλληλουχίας τους με άλλα είδη εντόμων. Ο αντίστοιχος αριθμός ειδο-ειδικών lncRNAs του Ae. aegypti ήταν 3.6403 από τα 4.709 χαρακτηρισμένα γονίδια (77,4%). Συνολικά, η παρούσα μελέτη παρουσίασε για πρώτη φορά ειδο-ειδικά lncRNAs με μεγάλες δυνατότητες χρήσης τους σε προσεγγίσεις ελέγχου των παρασιτικών εντόμων, ιδίως τα Norma3 και Zinc22 δύο lncRNA που ρυθμίζουν τη γονιμότητα των θηλυκών κουνουπιών Ae. albopictus και Ae. aegypti. Η ειδο-ειδικότητα αποτελεί σημαντικότατο ζήτημα κατά την ανάπτυξη των εντομοκτόνων, λόγω των σοβαρών βλαβών που προκαλούν σε έντομα μη-στόχους, όπως τα ωφέλιμα έντομα, οι επικονιαστές και οι φυσικοί θηρευτές. Η ειδο-ειδικότητα σε συνδυασμό με την υψηλή αποτελεσματικότητα είναι οι απώτεροι στόχοι κατά την ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων για τον έλεγχο των εντόμων. Η υψηλή ειδο-ειδικότητα των επιλεγμένων lncRNAs σε συνδυασμό με τη λειτουργική τους σημασία τα καθιστούν ιδανικούς υποψήφιους μοριακούς στόχους νέων φυτοφαρμάκων.