Innovative methods for insect control and insecticide resistance management

Abstract

Insect pests pose devastating consequences in both agriculture and public health. Most of the control strategies employed rely on the use of chemical insecticides. However, the heavy use of the same chemical compounds have led to the natural selection of insecticide resistance phenotypes in the field. Functional validation of insecticide resistance mechanisms is a necessary step to manage and cope with this phenomenon, through the development of diagnostic molecular tools and/or generation of efficient insecticidal compounds. In the first two chapters we used Drosophila melanagaster as a tool to functionally validate mechanisms that have been associated with resistance against Sodium Channel Blocker Insecticides (SCBIs) and pyrethroids, two different classes of neurotoxic insecticides. In the first chapter we dealt with two certain point mutations in the voltage gated sodium channel that have been previously associated with resistance against SCBIs. To validate and measure the size of the resistance that each of them confers, we employed CRISPR/Cas9 technology to generate Drosophila strains harboring each of the two mutations (F1845Y or V1848I) in the voltage gated sodium channel (para) gene. Toxicity bioassays have revealed that both of them confer resistance against indoxacarb and metaflumizone, when compared to wild type control lines, but their effect size was not uniform. In the second chapter we sought to validate a putative synergistic interaction between metabolic and target site resistance mechanisms against pyrethroids, a class of insecticides that is frequently used for the control of mosquito-vectors such as Aedes aegypti. Several resistance loci found in this species have been associated and functionally correlated (individually) with pyrethroid resistance. However, the most prevalent are mutations in the para gene (e.g. V1016G) and increased pyrethroid detoxification mediated by overexpressed P450s (e.g. CYP9J28). Herein, we combined standard genetics and CRISPR/Cas9 system, to generate Drosophila strains that combine both of these resistance alleles in the same genetic background. Toxicity bioassays have revealed that there is a synergistic interaction between these pyrethroid resistance alleles, yielding resistance ratios greater than the product of the resistance ratios obtained for the individual mechanisms (RRcombination: 19.85 >> RRCYP9J28:1.78 X RRV1016G: 3.00). The first two chapters provided essential information to understand novel mechanisms of resistance to insecticides, as well as to evaluate and interpret the validity of the available molecular diagnostics that they are used for monitoring resistance in the field. Considering the impacts of insecticide resistance in pest control management, it is necessary to develop alternative methods (such as biotechnology based) for effective and sustainable pest control, and the next two chapters are under this framework. In Chapter 3, we tried to develop a genetic toolkit for the non-model species Helicoverpa armigera. In particular we have identified and functionally characterized 4 strong RNA-Pol II promoters with strong activity in the midgut derived cell line RP-HzGUT-AW1(MG). Additionally, we characterized 4 functional U6 promoters (RNA-Pol III promoters), able to induce the expression of shRNAs and sgRNAs for RNAi and CRISPR respectively. In Chapter 4 we opted to functionally characterize the OATP74D of two lepidoptera pests, as a putative ecdysone transporter and insecticide target. First, we generated a mutant clone of the cell line RP-HzGUT-AW1(MG), that harbors a deletion in the Oatp74D. Disruption of this gene lead to inability of the activation of the ecdysone pathway, as treatment of the mutant cells with ecdysone did not alter the expression of ecdysone responsive genes, in regard with the wild type cells. Moreover, we generated cell lines overexpressing the Oatp74D of H. armigera and S. frugiperda, which indicated that both of them are sufficient to induce ecdysone dependent gene transcription. Inhibition analysis also denoted that both of these proteins are sensitive to inhibitors of organic anion transporters. Moreover, CRISPR mediated partial disruption of the gene in S. frugiperda increased the lethality rates, compared to the negative control. Taken all together, we conclude that lepidoptera OATP74D is an essential protein, sensitive to inhibitors that could be used in the future as a potent insecticide target. In this context we have also generated a cell-based platform for screening candidate chemical compounds against these proteins - targets.

Ως έντομα εχθροί ορίζονται τα έντομα που προκαλούν σοβαρές επιπτώσεις στις αγροτικές καλλιέργειες αλλά και στη δημόσια υγεία. Ο έλεγχος αυτών πραγματοποιείται κατά κύριο λόγο με τη χρήση των εντομοκτόνων. Παρόλα αυτά η αλόγιστη χρήση στο πεδίο έχει οδηγήσει στη φυσική επιλογή πολλών διαφορετικών ανθεκτικών φαινοτύπων. Η λειτουργική ανάλυση των μοριακών μηχανισμών ανθεκτικότητας είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη διαχείριση και την αντιμετώπιση του φαινομένου, για παράδειγμα μέσω της ανάπτυξη μοριακών διαγνωστικών ή βελτιωμένων σκευασμάτων. Στα πρώτα δύο κεφάλαια χρησιμοποιήσαμε τον οργανισμό μοντέλο Drosophila melanogaster για να μελετήσουμε συγκεκριμένους μηχανισμούς που έχουν συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα σε δύο κλάσεις νευροτοξικών εντομοκτόνων, τα πυρεθροειδή καθώς και τα Sodium Channel Blocker Insecticides (SCBIs). Συγκεκριμένα στο πρώτο κεφάλαιο μελετήθηκαν δύο μεταλλαγές του τασεοευαίσθητου καναλιού νατρίου (F1845Y ή V1848I), οι οποίες έχουν συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα ενάντια στα εντομοκτόνα indoxacarb και metaflumizone, που ανήκουν στην κατηγορία των SCBIs. Για το σκοπό αυτό, κατασκευάστηκαν αμιγή στελέχη μυγών που φέρουν σε ομόζυγη κατάσταση μία από τις δύο μεταλλαγές, χρησιμοποιώντας την τεχνική γονιδιωματικής τροποποίησης CRISPR/Cas9. Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκαν βιοδοκιμές τοξικότητας με σκοπό την αξιολόγηση της συνεισφοράς της εκάστοτε μεταλλαγής στην ανθεκτικότητα ενάντια στα δύο εντομοκτόνα, που έδειξαν ότι και οι δύο μεταλλαγές συνεισφέρουν στην ανθεκτικότητα ενάντια στο indoxacarb και στο metaflumizone, με διαφορετική ωστόσο ένταση στο φαινότυπο. Στο επόμενο κεφάλαιο μελετήθηκε η πιθανή συνεργιστική αλληλεπίδραση δύο διαφορετικών μηχανισμών ανθεκτικότητας ενάντια στα πυρεθροειδή, μία κλάση εντομοκτόνων που χρησιμοποιείται ευρέως για την καταπολέμηση εντόμων φορέων ασθενειών όπως είναι τα κουνούπια Aedes aegypti. Ανάμεσα στην πληθώρα γενετικών αλληλομόρφων που έχουν ταυτοποιηθεί στο είδος Aedes aegypti, τα πιο συνήθη φαίνεται να είναι οι μεταλλαγές στο τασεοευαίσθητο κανάλι νατρίου (π.χ. η μεταλλαγή στο σημείο V1016G) καθώς και η υπερέκφραση ενζύμων αποτοξικοποίησης (π.χ. η μονοοξυγενάση του κυτοχρώματος P450 CYP9J28). Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν διαγονιδιακά στελέχη μυγών που φέρουν τη μεταλλαγή V1016G στο γονίδιο para (κανάλι νατρίου) σε συνδυασμό με την ιστοειδική υπερέκφραση του ενζύμου CYP9J28. Βιοδοκιμές τοξικότητας υπέδειξαν τη συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο μηχανισμών που οδηγεί σε μεγαλύτερο συντελεστή ανθεκτικότητας, σε σχέση με το γινόμενο των επιμέρους επιπέδων ανθεκτικότητας (RRcombination: 19.85 >> RRCYP9J28:1.78 X RRV1016G: 3.00). Τα αποτελέσματα των δύο πρώτων κεφαλαίων μας βοηθούν στην κατανόηση νέων μηχανισμών ανθεκτικότητας και στην αξιολόγηση της αξίας επιμέρους μοριακών διαγνωστικών που εφαρμόζονται για την παρακολούθηση του φαινoμένου. Δεδομένης της ανθεκτικότητας, κρίνεται απαραίτητο να αναπτυχθούν και εφαρμοστούν εναλλακτικές μέθοδοι (όπως βιοτεχνολογικές) διαχείρισης των εντόμων και στο πλαίσιο αυτό εντάσσονται τα επόμενα δύο κεφάλαια της διατριβής. Στο κεφάλαιο 3 ταυτοποιήθηκαν υποκινητές εξαρτώμενοι από τις RNA πολυμεράσες II και III του είδους Helicoverpa armigera, με σκοπό την βιοτεχνολογική εφαρμογή τους. Συγκεκριμένα ταυτοποιήθηκαν 4 υποκινητές που εμφανίζουν υψηλή ενεργότητα σε κυτταρική σειρά προερχόμενη από το μεσέντερο λεπιδοπτέρων (RP-HzGUT-AW1(MG)), καθώς και 4 υποκινητές που έχουν την ικανότητα να επάγουν την έκφραση μικρών RNAs (π.χ. shRNAs και sgRNAs), τα οποία αποτελούν βασικό συστατικό τεχνικών γενετικής τροποποίησης (RNAi και CRISPR). Στο κεφάλαιο 4 πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση της πρωτεΐνης OATP74D ως πιθανού μεταφορέα εκδυσόνης καθώς και χαρακτηρισμός της ως πιθανού στόχου για εντομοκτόνα. Αρχικά με τη χρήση των πλασμιδίων CRISPR που κατασκευάστηκαν στο κεφάλαιο 3, κατέστη εφικτή η κατασκευή μεταλλαγμένης για το γονίδιο HzOatp74D μονοκλωνικής κυτταρικής σειράς RP-HzGUT-AW1(MG). Η απαλοιφή του γονιδίου οδήγησε σε αδυναμία ενεργοποίησης του μονοπατιού της εκδυσόνης, δεδομένου ότι δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων παρουσία της ορμόνης, συγκριτικά με την κυτταρική σειρά αγρίου τύπου. Επιπλέον η υπερέκφραση των ορθόλογων γονιδίων του Oatp74D από τα λεπιδόπτερα H. armigera και Spodoptera frugiperda, υπέδειξε ότι είναι ικανά να επαναφέρουν την ευαισθησία των κυττάρων στην εκδυσόνη. Εν συνεχεία κατασκευάστηκαν κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν μόνιμα τις πρωτεΐνες HaOATP74D και SfOATP74D με σκοπό τη χρήση τους ως πλατφόρμα για τον έλεγχο πιθανών αναστολέων, όπως η ριφαμπικίνη, που βρέθηκε να είναι ικανή να αναστείλει την είσοδο της εκδυσόνης ενδοκυτταρικά. Μερική απαλοιφή του γονιδίου Oatp74D στο λεπιδόπτερο S. frugiperda (in vivo), υπέδειξε την αναγκαιότητα του γονιδίου αυτού για την ανάπτυξη των εντόμων. Καταλήγοντας, είναι η πρώτη φορά που αποδεικνύεται ότι η μεταφορά εκδυσόνης πραγματοποιείται μέσω του μεταφορέα OATP74D στα λεπιδόπτερα. Επιπλέον αποδείχθηκε ότι η πρωτεΐνη αυτή έχει ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη των εντόμων H. armigera και S. frugiperda, και ότι η δράση της μπορεί να ανασταλεί από χημικούς αναστολείς, ευρήματα τα οποία αναδεικνύουν το ρόλο της μελλοντικά ως πιθανό στόχο εντομοκτόνων.