Πολυκεντρική επιδημιολογική μελέτη της ύπαρξης γονιδίων που κωδικοποιούν 16S rRNA μεθυλάσες και προσδίδουν αντοχή στις αμινογλυκοσίδες σε GRAM-αρνητικά βακτήρια που απομονώνονται από νοσηλευόμενους ασθενείς

Abstract

Methylation of 16S ribosomal RNA (rRNA) has emerged as a novel aminoglycoside resistance mechanism in pathogenic gram-negative bacteria since 2003 and is increasingly reported worldwide.Ten different genes (rmtA, rmtB, rmtC, rmtD, rmtE, rmtF, rmtG, rmtH, armA and npmA) that encode the respective enzymes have been described to date, not only in clinical but also in veterinary strains and their presence confers high-level resistance to all clinically relevant aminoglycosides. These genes are mostly located on transposons within transferable plasmids, which provides them with the potential to spread horizontally and may in part explain the rapid worldwide distribution among Enterobacterales and non-glucose-fermenting bacilli of human and animal origin. One great concern is the multidrug resistance development in RMT-producing pathogenic bacteria through further accumulation of various antimicrobial resistance genes such as carbapenem-hydrolyzing β- lactamases. Thus far, RMTs have been reported from at least 30 countries or regions. The worldwide dissemination is becoming a serious global concern and this implies the necessity to continue investigations on the trend of RMTs to restrict their further distribution.The aim of this study was to investigate the prevalence of 16S rRNA methylases in consecutively collected Gram-negative isolates (Enterobacterales, P. aeruginosa and Acinetobacter spp.) from patients treated in major hospitals in Athens Metropolitan area and the Greek province during a two-year period (2015 – 2016). An additional goal was to study their genetic background and their coexistence with resistance genes for other groups of antimicrobials, such as β-lactams (β-lactamases), carbapenems (carbapenemases) and quinolones (qnr, aac (6 ') - cr, oqxAB), in the same conjugative plasmids.The study took place at the Infectious Diseases Laboratory of the 4th Department of Internal Medicine of the National and Kapodistrian University of Athens in Greece. Single-patient, Gram-negative clinical isolates (Enterobacterales, P. aeruginosa or Acinetobacter spp.), resistant to both amikacin and gentamicin, were collected from the Microbiology Departments of the collaborating hospitals. All isolates were sent to the central laboratory for MIC determination to various aminoglycosides with the broth dilution technique. Highly resistant isolates were examined for the presence of 16S rRNA methylase (RMT) genes (armA, rmtB, rmtC, rmtA, rmtD and npmA) by PCR. In all RMT-producing isolates, ESBL and carbapenemase production was confirmed by PCR, and the clonal relatedness and the plasmid contents were also characterized. The possible plasmid locus of the rmtB gene found in Enterobacterial strains, its transferability, and the coexistence of other resistance genes in the same plasmid were then tested. Finally, the plasmids carrying rmtB isolated from different genera/genotypes of Enterobacterial strains were compared with each other. As all RMT-positive Enterobacterales were also carbapenemase producers, another nationwide collection of carbapenemase-producing K. pneumoniae isolates (of the same time-period) was tested, with the aim of estimating the prevalence of RMT-production for this specific population.ArmA predominates among the aminoglycoside-resistant clinical strains of A. baumannii in Greek hospitals. These strains also produce carbapenemases, mainly OXA-23, they are XDR or PDR, and belong to the international clone IC II. In enterobacterial strains, a clear association of 16S rRNA methylase (RmtB) production with carbapenemase genes has also been observed, causing particular concern, as this combination confers resistance to many antibiotic classes used to treat Gram infections. The prevalence of RMT genes among the carbapenemase-producing K. pneumoniae isolates was 6.8%.Very high rates of colistin resistance were observed in both A. baumannii strains and K. pneumoniae strains. Fosfomycin was the most active agent against all Enterobacterales, while the combinations of ceftazidime / avibactam and meropenem / vaborbactam showed excellent activity against K. pneumoniae strains, that produced KPC and/or OXA-48 the former and KPC the latter.In addition, this study demonstrated a promising in vitro effect of apramycin against XDR and PDR A. baumannii strains, but also against the MDR K. pneumoniae strains, thus justifying the need for its further evaluation for the treatment of infections by these strains, as it may be the basis for designing derivative drugs with even better action and reduced toxicity.The detection of rmtB in a conjugative plasmid, together with the blaVEB, blaOXA-10 and blaTEM genes, as well as the detection of blaVIM and blaSHV in the same plasmid in P. mirabilis, P. stuartii, and E. coli strains also raise great concern, implying the need for monitoring as well as measures to limit its spread.In conclusion, the production of 16S rRNA methylases is an emerging mechanism of resistance, capable of jeopardizing the clinical efficacy of all aminoglycosides, including even newer ones that have not yet been clinically used.

Η μεθυλίωση του 16S ριβοσωμικού RNA (rRNA) έχει αναφερθεί σαν ένας αναδυόμενος μηχανισμός αντοχής στις αμινογλυκοσίδες σε παθογόνα Gram-αρνητικά μικρόβια από το 2003 και αναφέρεται όλο και περισσότερο παγκοσμίως. Δέκα διαφορετικά γονίδια (rmtA, rmtB, rmtC, rmtD, rmtE, rmtF, rmtG, rmtH, armA, npmA) που κωδικοποιούν τα αντίστοιχα ένζυμα έχουν περιγραφεί μέχρι σήμερα, σε κλινικά αλλά και σε κτηνιατρικά στελέχη, και προσδίδουν υψηλού επιπέδου αντοχή σε όλες τις κλινικά χρησιμοποιούμενες αμινογλυκοσίδες. Τα γονίδια αυτά βρίσκονται κυρίως σε τρανσποζόνια πάνω σε συζευκτικά πλασμίδια που τους δίνουν τη δυνατότητα οριζόντιας εξάπλωσης, γεγονός που μπορεί εν μέρει να εξηγήσει την παγκόσμια εξάπλωση αυτού του μηχανισμού σε μικρόβια της οικογένειας των Εντεροβακτηριακών και σε μη ζυμωτικά βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των P. aeruginosa και Acinetobacter spp. Μεγάλη ανησυχία προκαλεί η ανάπτυξη πολυαντοχής των μικροβίων που παράγουν 16S rRNA μεθυλάσες μέσω της συσσώρευσης διαφόρων γονιδίων μικροβιακής αντοχής, καθώς αρκετά από αυτά τα στελέχη έχουν βρεθεί να παράγουν ταυτόχρονα και καρβαπενεμάσες ή ευρέος φάσματος β-λακταμάσες. Μέχρι στιγμής, έχουν αναφερθεί 16S rRNA μεθυλάσες σε τουλάχιστον 30 χώρες ή περιοχές. Η παγκόσμια εξάπλωσή τους εξελίσσεται σε μια σοβαρή απειλή, γεγονός που συνεπάγεται την ανάγκη συνέχισης της έρευνας με απώτερο σκοπό τον περιορισμό της περαιτέρω διάδοσής τους.Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της ύπαρξης γονιδίων που κωδικοποιούν 16S rRNA μεθυλάσες στα Εντεροβακτηριακά στελέχη αλλά και στα στελέχη P. aeruginosa και Acinetobacter spp. που απομονώνονται από καλλιέργειες ασθενών που νοσηλεύονται σε μεγάλα νοσοκομεία της Αθήνας και ο ακριβής επιπολασμός τους τα έτη 2015 - 2016. Επιπρόσθετος στόχος ήταν η μελέτη του γενετικού υποστρώματός τους και της συνύπαρξής τους με γονίδια αντοχής για άλλες ομάδες αντιμικροβιακών, όπως οι β-λακτάμες (β-λακταμάσες), οι καρβαπενέμες (καρβαπενεμάσες) και οι κινολόνες (qnr, aac(6’)-cr, oqxAB), στα ίδια συζευτικά πλασμίδια.Η συλλογή και μελέτη των στελεχών έγινε στο Ερευνητικό Εργαστήριο Λοιμώξεων και Αντιμικροβιακής Θεραπείας της Δ’ Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Από τα μικροβιολογικά εργαστήρια των συνεργαζόμενων νοσοκομείων συλλέχθηκαν Gram-αρνητικά στελέχη (Εντεροβακτηριακά, P.aeruginosa ή Acinetobacter spp.) που παρουσίαζαν ταυτόχρονα αντοχή στην αμικασίνη και στην γενταμικίνη. Τα στελέχη συγκεντρώθηκαν στο κεντρικό εργαστήριο, όπου έγινε προσδιορισμός των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (MIC) στις αμινογλυκοσίδες αμικασίνη, γενταμικίνη, τομπραμυκίνη και απραμυκίνη. Ακολούθησε μοριακός έλεγχος με PCR για ανίχνευση γονιδίων 16S rRNA μεθυλοτρανσφερασών στα στελέχη που παρουσίαζαν υψηλού επιπέδου αντοχή. Όσον αφορά την αντοχή σε άλλα αντιβιοτικά, προσδιορίστηκε η ευαισθησία των RMT-θετικών στελεχών σε όλες τις κλινικά σημαντικές ομάδες αντιμικροβιακών, ενώ με μοριακό έλεγχο έγινε η διερεύνηση για την ύπαρξη καρβαπενεμασών και για την κλωνικότητα των στελεχών ανά είδος. Στη συνέχεια ελέγχθηκε η πιθανή πλασμιδιακή θέση του γονιδίου rmtB που βρέθηκε στα Εντεροβακτηριακά στελέχη, η δυνατότητα μεταφοράς του, καθώς και η συνύπαρξη στο ίδιο πλασμίδιο άλλων γονιδίων αντοχής. Τέλος έγινε σύγκριση των πλασμιδίων που έφεραν το rmtB και είχαν απομονωθεί από διαφορετικούς γονότυπους Εντεροβακτηριακών στελεχών. Καθώς παρατηρήθηκε ότι όλα τα RMT-θετικά Εντεροβακτηριακά στελέχη παρήγαγαν καρβαπενεμάση, ελέγθηκε επιπλέον και μια πανελλήνια συλλογή κλινικών στελεχών K. pneumoniae που παρήγαγαν καρβαπενεμάση (της ίδιας χρονικής περιόδου) για να μελετηθεί ξεχωριστά ο επιπολασμός των RMTs στην ομάδα αυτή.Η μεθυλάση ArmA κυριαρχεί μεταξύ των ανθεκτικών στις αμινογλυκοσί-δες κλινικών στελεχών A. baumannii, που κυκλοφορούν στα νοσοκομεία της Αθήνας. Τα στελέχη αυτά παράγουν παράλληλα καρβαπενεμάση, κατά κύριο λόγο ΟΧΑ-23, είναι XDR ή PDR, και ανήκουν στον διεθνή κλώνο IC II. Στα Εντεροβακτηριακά στελέχη παρατηρήθηκε επίσης σαφής συσχέτιση της παραγωγής μεθυλάσης RmtB με γονίδια καρβαπενεμάσης, γεγονός ιδιαίτερα ανησυχητικό, καθώς οι RMTs και οι καρβαπενεμάσες προσδίδουν αντοχή σε πολλές κατηγορίες αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των λοιμώξεων από Gram-αρνητικά βακτήρια. Όσον αφορά τη συλλογή των στελεχών K. pneumoniae που παρήγαγαν καρβαπενεμάση, το 6.8% των στελεχών βρέθηκε να παράγει και μεθυλάση.Πολύ υψηλά ποσοστά αντοχής στην κολιστίνη παρατηρήθηκαν τόσο στα στελέχη A. baumannii, όσο και στα στελέχη K.pneumoniae. Η φωσφομυκίνη ήταν ο πιο δραστικός παράγοντας έναντι του συνόλου των Εντεροβακτηριακών, ενώ οι συνδυασμοί κεφταζιδίμης/αβιμπακτάμης και μεροπενέμης/ βαμπορμπακτάμης έδειξαν άριστη δράση έναντι των στελεχών K. pneumoniae που παρήγαγαν KPC ή/και OXA-48 ο πρώτος και KPC ο δεύτερος.Επιπλέον, αυτή η μελέτη κατέδειξε μια πολλά υποσχόμενη in vitro δράση της απραμυκίνης έναντι των XDR και PDR A. baumannii στελεχών, αλλά και έναντι των πολυανθεκτικών στελεχών K. pneumoniae, που δικαιολογεί περαιτέρω αξιολόγηση της για τη θεραπεία λοιμώξεων από αυτά τα στελέχη, καθώς μπορεί να αποτελέσει βάση για σχεδιασμό παραγώγων με ακόμη καλύτερη δράση και μειωμένη τοξικότητα.Ο εντοπισμός του rmtB σε συζευκτικό πλασμίδιο, μαζί με τα γονίδια blaVEB, blaOXA-10 και blaTEM, καθώς και ο εντοπισμός των blaVIM και blaSHV στο ίδιο πλασμίδιο σε στελέχη P. mirabilis, P. stuartii, και E. coli, κάνει την κατάσταση ακόμη πιο ανησυχητική και επιβάλει την ανάγκη για παρακολούθηση καθώς και τη λήψη μέτρων για τον περιορισμό της εξάπλωσης του.Συμπερασματικά, η παραγωγή 16S rRNA μεθυλασών είναι ένας αναδυόμενος μηχανισμός αντοχής, ικανός να θέσει σε κίνδυνο την κλινική αποτελεσματικότητα όλων των αμινογλυκοσιδών, ακόμα και των νεότερων που δεν βρίσκονται ακόμα σε κλινική χρήση.