Molecular characterization of pesticide resistance in Bemisia tabaci and Tetranychus urticae and the development of diagnostics

Abstract

The ability of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) to transmit viral diseases, combined with the development of insecticide resistance and the rapid spread of new biotypes in new areas, make this species one of the most important agricultural pests. The spider mite Tetranychus urticae is one of the most important agricultural pests, feeding on more than 1000 different plant species, creating serious problems in rural crops in areas with temperate climate such as in the Mediterranean countries. Many active ingredients are approved for their control in our country, however, due to wrong and/or intensive use of insecticides, resistance has occurred. The main goal of this PhD study is to gain a deeper understanding of the mechanisms of insecticide resistance, to elucidate and functionally validate resistant phenotypes observed, as well as to develop a diagnostic tool to assist Insecticide Resistance Management (IRM).In the 2nd chapter of this Thesis, a T. urticae field population was collected from Peloponnese and after toxicity and synergistic assays, extremely high resistance levels to abamectin, etoxazole, clofentezine, cyflumetofen, fenpyroximate and spirodiclofen, were revealed. In addition, transcriptomic analyses unveiled P450s and UGTs that were over-expressed, on top of known target-site mutations associated with resistance. Several interesting SNPs were also uncovered in genes targeted by cyflumetofen [succinate dehydrogenase subunit D (SdhD)], abamectin [glutamate chloride channel 3 (GluCl3) and ketoenols [acetyl-CoA carboxylase (ACC)] genes that were subsequently validated by employing different approaches.In the 3rd chapter, four substitutions were functionally validated, using the CRISPR-Cas9 genome editing technique in the model organism Drosophila melanogaster, to elucidate their role in resistance to different insecticides/ acarides. The first substitution was detected in a ketoenol resistant population of B. tabaci, in the ACC gene in position 2083, where an alanine was substituted by a valine. The second substitution was identified in the ACC gene of spiromesifen (ketoenol) resistant Trialeurodes vaporariorum strains, with a glutamic acid substitution with lysine in position 645. The last two substitutions were identified in T. urticae strains. After selection pressure with ketoenols, a substitution was revealed in the ACC gene, in position 1079 with an alanine substituted by threonine while T. urticae field collected populations were abamectin resistant and after sequencing of GluCls, a substitution in GluCl3 was detected in position 321 where isoleucine was substituted by threonine. Different fly lines were generated, bearing the A2083V, A1079T and I321T mutations, except E645K, where the mutation was lethal at homozygous state. Toxicity bioassays using flies bearing the A2083V mutation, confirmed its very crucial role in ketoenol resistance with the genome modified flies being resistant to all three available ketoenol compounds (spirodiclofen, spiromesifen and spirotetramat) with Resistant Ratios (RR) >870-fold, when compared to the parental flies. Drosophila lines bearing I321T revealed moderate resistance to abamectin, and along with further experiments, it was concluded that I321T mutation has a complex role in abamectin resistance. In contrast, A1079T mutation found in a T. urticae ketoenol resistant strain, could not be associated with ketoenol resistance, using the Drosophila system. In the 4th chapter, the observed resistance in the T. urticae field collected population from Peloponnese was further investigated concerning resistance to ketoenols (spirodiclofen) and METI-II (cyflumetofen) acaricides. The already multi-resistant population was selected with spirodiclofen until resistance levels were very high (>5000 mgL-1) and was further crossed with a susceptible population. The progeny was divided in nine unsprayed (control), nine spirodiclofen-selected and nine cyflumetofen-selected populations and subsequently, Bulk Segregant Analysis (BSA) was performed. After the selection process, which lasted many generations, DNA and RNA analysis will be performed as well as the BSA genetic mapping, to identify genomic loci associated with the observed resistant phenotype.Resistance to abamectin in T. urticae has been associated with a P450, CYP392A16, that has been functionally validated in vitro showing that it metabolizes abamectin to a less toxic compound. In the 5th chapter, CYP392A16 from an abamectin resistant T. urticae population was introgressed in a susceptible genetic background by marker-assisted backcrosses and via toxicity assays and qPCR, it was unveiled that the CYP392A16 allele deriving from the resistant population provides 3.6-folds abamectin resistance and CYP392A16 is also overexpressed, at the same levels as in the resistant population, following the introgression. In addition, RNAi experiments against CYP392A16, showed that the expression levels of CYP392A16 are downregulated by almost 50% in the resistant population, on top of reducing the insecticide resistance levels from 3400- to 1900- fold, when compared to the susceptible strain. Furthermore, functional analysis of the putative promoter region from the resistant and susceptible strains revealed a higher reporter gene expression in the resistant strain, indicating the presence of cis-acting regulatory mechanisms, which is in line with the over-expression of this P450, when introgressed in a susceptible background. A specific antibody against CYP392A16 was raised and localization experiments indicated that CYP392A16 is primarily localized in the midgut epithelial cells, also supported by the comparison between feeding and contact toxicity bioassays.In the 6th chapter, six T. urticae and eleven B. tabaci field populations collected from different sites of Crete were used for the development of diagnostic assays, to manage field observed resistance. More specifically, known target-site mutations associated with resistance to pesticides with different Mode of Action (MoA) were employed, to monitor the frequency of resistant and susceptible alleles in field populations. We developed a panel of eleven TaqMan assays for T. urticae and four TaqMan assays for B. tabaci where individuals can be screened in addition to a novel, high-tech and highly sensitive version of PCR, the droplet digital PCR (ddPCR), with very high sensitivity and accuracy in bulk (pooled) samples, that can detect resistant alleles even in very low frequency (1 mutant allele in 999 susceptible alleles). The outcome revealed both multi-resistant and susceptible populations of T. urticae and B. tabaci in Crete.

Η ικανότητα του αλευρώδη B. tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) να μεταδίδει ιϊκές ασθένειες, σε συνδυασμό με την ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα και τη γρήγορη εξάπλωση νέων βιοτύπων σε νέες περιοχές, καθιστούν αυτό το είδος έναν από τους σημαντικότερους εχθρούς καλλιεργειών. Το άκαρι T. urticae είναι επίσης ένας από τους πιο σημαντικούς εχθρούς καλλιεργειών καθώς προσβάλλει πάνω από 1000 διαφορετικά είδη φυτών, δημιουργώντας σημαντικά προβλήματα σε αγροτικές καλλιέργειες περιοχών με αυξημένες θερμοκρασίες, όπως οι Μεσογειακές χώρες. Πολλές δραστικές ουσίες έχουν εγκριθεί για την καταπολέμησή τους, αλλά λόγω της εκτεταμένης και συχνά, λάθος χρήσης τους, έχει εμφανιστεί ανθεκτικότητα. Ο στόχος της Διδακτορικής αυτής διατριβής είναι η απόκτηση βαθύτερης κατανόησης στους μηχανισμούς ανθεκτικότητας στα εντομοκτόνα, η αποσαφήνιση και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός ανθεκτικών φαινοτύπων και η ανάπτυξη ενός διαγνωστικού εργαλείου με απώτερο σκοπό τη συμμετοχή στην προσπάθεια διαχείρισης της ανθεκτικότητας στο πεδίο. Στο 2ο κεφάλαιο της διατριβής, ένας πληθυσμός τετρανύχου, ο οποίος συλλέχθηκε από θερμοκήπιο στην Τροιζήνα της Πελοποννήσου, εξετάσθηκε ως προς την ανθεκτικότητα του, χρησιμοποιώντας εντομοκτόνα αλλά και συνεργιστές εντομοκτόνων, πραγματοποιώντας βιοδοκιμές τοξικότητας. Οι βιοδοκιμές αυτές έδειξαν πως ο πληθυσμός ήταν ανθεκτικός σε πολλά εντομοκτόνα διαφορετικού στόχου (abamectin, etoxazole, clofentezine, cyflumetofen, fenpyroximate και spirodiclofen). Επιπροσθέτως, η ανάλυση μεταγραφώματος έδειξε την υπερέκφραση κάποιων κυτοχρωμικών οξειδασών (P450) και UDP-γλυκουρονιλ-τρανσφερασών (UGT), σε συνάρτηση με γνωστές μεταλλαγές στόχου οι οποίες έχουν ήδη συσχετιστεί με ανθεκτικότητα στόχου. Νέες αμινοξικές αλλαγές βρέθηκαν σε τρεις στόχους εντομοκτόνων, στη D υπομονάδα της σουκινικής δεϋδρογονάσης (SdhD) που είναι στόχος των ΜΕΤΙ ΙΙ εντομοκτόνων, στο τρίτο κανάλι χλωρίου (GluCl3) που είναι στόχος του εντομοκτόνου abamectin και στην καρβοξυλάση του ακέτυλο-συνενζύμου Α (ACC) που είναι στόχος των κετοενολών, οι οποίες εν συνεχεία χαρακτηρίστηκαν, χρησιμοποιώντας διαφορετικές προσεγγίσεις. Στο 3ο κεφάλαιο της διατριβής, στόχος ήταν ο λειτουργικός χαρακτηρισμός μεταλλαγών στόχου που έχουν βρεθεί σε ανθεκτικούς πληθυσμούς πεδίου, χρησιμοποιώντας την τεχνική γενετικής τροποποίησης CRISPR-Cas9, στο μοντέλο-οργανισμό Drosophila melanogaster. Πιο συγκεκριμένα, σε έναν Ισπανικό πληθυσμό αλευρώδη (B. tabaci) ο οποίος ήταν ανθεκτικός στις κετοενόλες, βρέθηκε μία μεταλλαγή (A2083V) στην καρβοξυτελική περιοχή του γονιδίου στόχου των κετοενολών, την καρβοξυλάση του ακετυλο-συνενζύμου Α (ACC). Σε πληθυσμούς τριαλευρώδη (Trialeurodes vaporariorum) και τετρανύχου (T. urticae), συλλεγμένους από το πεδίο και μετά από πίεση επιλογής με εντομοκτόνα κετοενολών, βρέθηκαν οι μεταλλαγές Ε645Κ και Α1079Τ, αντίστοιχα, στο γονίδιο της καρβοξυλάσης του ακετυλο-συνενζύμου Α. Επιπροσθέτως, σε πληθυσμούς τετρανύχου ανθεκτικούς στην αβερμεκτίνη abamectin, που στοχεύει τα κανάλια χλωρίου (GluCl), βρέθηκε η σημειακή μεταλλαγή I321T στο τρίτο κανάλι χλωρίου (GluCl3). Διαφορετικές σειρές μυγών δημιουργήθηκαν, όπου η κάθε μία έφερε μία από τις μεταλλαγές A2083V, A1079T και I321T σε ομοζυγωτία, εκτός από τη μεταλλαγή E645K, η οποία ήταν θνησιγόνος σε ομόζυγη κατάσταση. Βιοδοκιμές τοξικότητας με τετρονικά οξέα (spirodiclofen, spiromesifen and spirotetramat) σε μύγες που έφεραν τη μεταλλαγή A2083V, επιβεβαίωσαν τον πολύ σημαντικό ρόλο της στον ανθεκτικό φαινότυπο που είχε βρεθεί, καθώς ήταν 870 φορές πιο ανθεκτικές σε σχέση με το αρνητικό κοντρόλ. Οι μύγες οι οποίες έφεραν τη μεταλλαγή I321T σε ομοζυγωτία, έδειξαν μέτρια ανθεκτικότητα στην αβερμεκτίνη abamectin κατά τις βιοδοκιμές τοξικότητας, όπου συμπληρωματικά πειράματα υπέδειξαν έναν περίπλοκο ρόλο της μεταλλαγής στον ανθεκτικό φαινότυπο. Εν αντιθέσει, η μεταλλαγή Α1079Τ του τετρανύχου δεν έδειξε καμία συμμετοχή στον ανθεκτικό φαινότυπο στα τετρονικά οξέα.Στο 4ο κεφάλαιο, ο πληθυσμός τετρανύχου που συλλέχθηκε από την Πελοπόννησο, διερευνήθηκε περαιτέρω σε σχέση με την ανθεκτικότητά του στις κετοενόλες (ketoenols: spirodiclofen) και στους αναστολείς μεταφοράς ηλεκτρονίων στο μιτοχονδριακό σύμπλεγμα ΙΙ (ΜETI-II: cyflumetofen). Ο ήδη ανθεκτικός αυτός πληθυσμός επιλέχθηκε για αρκετές γενιές με την κετοενόλη spirodiclofen, έως ότου η ανθεκτικότητα υπερέβαινε τα 5000 mg L-1 εντομοκτόνου. Έπειτα, διασταυρώθηκε με έναν ευαίσθητο πληθυσμό με τους απογόνους της διασταύρωσης να χωρίζονται σε υποπληθυσμόυς όπου 9 εξ’ αυτών διατηρήθηκαν χωρίς επιλογή εντομοκτόνου (control), εννέα διατηρήθηκαν υπό αυξανόμενες συγκεντρώσεις spirodiclofen (spirodiclofen-selected) ενώ εννέα διατηρήθηκαν υπό αυξανόμενες συγκεντρώσεις cyflumetofen (cyflumetofen-selected), με σκοπό την πραγματοποίηση μαζικής ανάλυσης διαχωρισμού (BSA). Μετά από αρκετές γενιές επιλογής, άτομα από τους υποπληθυσμούς συλλέχθηκαν για ανάλυση γονιδιώματος, ώστε να βρεθούν γονιδιωματικές περιοχές οι οποίες σχετίζονται με την ανθεκτικότητα στα δύο αυτά εντομοκτόνα. Η ανθεκτικότητα στην αβερμεκτίνη abamectin του τετρανύχου έχει συσχετισθεί με μία P450, την CYP392A16, η οποία έχει χαρακτηρισθεί λειτουργικά in vitro και έχει δειχθεί πως έχει την ικανότητα να μεταβολίζει το abamectin σε ένα λιγότερο τοξικό μεταβολίτη. Στο 5ο κεφάλαιο, η CYP392A16 από ένα ανθεκτικό στέλεχος τετρανύχου έχει «εισαχθεί» σε ένα ευαίσθητο στέλεχος, όπου μέσω βιοδοκιμών τοξικότητας και PCR πραγματικού χρόνου (qPCR), δείχθηκε πως το αλληλόμορφο που προέρχεται από το ανθεκτικό στέλεχος προσδίδει 3.6 φορές μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στο abamectin και πως μετά την εισαγωγή του σε στέλεχος με ευαίσθητο γενετικό υπόβαθρο, εκφράζεται στα ίδια επίπεδα σε σχέση με το ανθεκτικό στέλεχος. Επιπροσθέτως, σίγηση της CYP392A16 του ανθεκτικού στελέχους έδειξε πως τα επίπεδα έκφρασής της μειώνονται περίπου στο 50% ενώ τα επίπεδα ανθεκτικότητας στο abamectin μειώθηκαν από τις 3400- στις 1900- φορές, σε σχέση με ευαίσθητο στέλεχος. Στο 6ο κεφάλαιο, έξι πληθυσμοί τετρανύχου και έντεκα πληθυσμοί αλευρώδη συλλέχθηκαν από διαφορετικά σημεία της Κρήτης και χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη διαγνωστικών αναλύσεων, που έχουν ως απώτερο στόχο τη διαχείριση της ανθεκτικότητας που παρατηρείται στο πεδίο. Πιο συγκεκριμένα, γνωστές μεταλλαγές στόχου που έχουν συσχετισθεί με ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα διαφορετικού τρόπου δράσης, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση της συχνότητας των ανθεκτικών και ευαίσθητων αλληλομόρφων σε πληθυσμούς πεδίου. Δημιουργήθηκε μία πλατφόρμα με έντεκα TaqMan αναλύσεις για τον τετράνυχο και τέσσερις TaqMan αναλύσεις για τον αλευρώδη, όπου άτομα τετρανύχου και αλευρώδη μπορούν να αναλυθούν. Επιπροσθέτως, μία πρωτότυπη, υψηλής τεχνολογίας και ευαισθησίας αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιήθηκε, η droplet digital PCR (ddPCR), η οποία προσφέρει μεγάλη ευαισθησία και ακρίβεια σε δείγματα πολλών ατόμων που αναλύονται ταυτόχρονα και μπορεί να ανιχνεύσει ανθεκτικά αλληλόμορφα, ακόμα και όταν αυτά βρίσκονται σε πολύ χαμηλή συχνότητα (ένα ανθεκτικό αλληλόμορφο σε εννιακόσια ενενήντα εννέα ευαίσθητα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στις περιοχές της Κρήτης υπάρχουν και ανθεκτικοί αλλά και ευαίσθητοι πληθυσμοί τετρανύχου και αλευρώδη.