Ανάπτυξη βιοαισθητήρων για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μυκοτοξινών

Abstract

Mycotoxins are chemical compounds produced by various fungal families that constitute a class of substances whose concentration should be determined in several food categories, but also in animal feed, due to the negative effects they have on human and animal health. The mycotoxins that are usually determined in food belong to three main categories: aflatoxins, fumonisins, and trichothecenes, from which the substances most frequently detected are aflatoxin B1 (AFM1), fumonisin B1 (FB1) and deoxinivalenol (DON). In this context, the aim of the present study was to develop a method for the simultaneous label-free immunochemical determination of the three mycotoxins implementing an optical sensor based on white light reflectance spectroscopy (WLRS). The sensor allows monitoring in real-time of biomolecular interactions by monitoring the changes in the interference spectrum reflected from a silicon chip modified with a silicon dioxide layer on which the reaction takes place. The determination of multiple analytes was accomplished by using chips with areas of varying thickness of silicon dioxide, each one of which has been biofunctionalized with a protein-conjugate of a different mycotoxin. For the assay, a mixture of calibrators or samples with a solution containing the anti-mycotoxin specific antibodies was run over the chip, followed by reaction with secondary for signal enhancement. A single reflection spectrum was received from all areas and it was deconvoluted into the spectrum of each individual area allowing the monitoring of the reactions taking place on it. The assay for the simultaneous determination of the three mycotoxins was fast (12 min) with detection limits 0.1, 1.25 and 1.0 ng/mL for AFB1, DON and FB1, respectively, and dynamic ranges extending to 5.0, 250 and 50 ng/mL, respectively. The sensor was applied to determine the three mycotoxins in cereal samples, mainly corn and wheat. Due to the lack of moving parts, the developed multi-analyte detection principle is expected to greatly facilitate the construction of a portable device determination of analytes at the point of need.

Οι μυκοτοξίνες είναι χημικές ενώσεις που παράγονται από διάφορες οικογένειες μυκήτων των οποίων η συγκέντρωση επιβάλλεται να προσδιορίζεται σε αρκετές κατηγορίες τροφίμων, λόγω των αρνητικών επιπτώσεων που έχουν στην υγεία των ανθρώπων και των ζώων. Οι μυκοτοξίνες που συνήθως ανιχνεύονται στα τρόφιμα ανήκουν κυρίως σε τρεις κατηγορίες: αφλατοξίνες, φουμονισίνες, και τριχοθηκίνες, με κύριους εκπροσώπους αυτών την αφλατοξίνη Β1 (AFB1), τη φουμονισίνη Β1 (FB1) και τη δεοξυνιβαλενόλη (DON). Στο πλαίσιο αυτό, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθόδου ανοσοχημικού προσδιορισμού των τριών μυκοτοξινών χωρίς τη χρήση ιχνηθετών με οπτικό αισθητήρα που βασίζεται στη φασματοσκοπία ανάκλασης λευκού φωτός. Ο αισθητήρας επιτρέπει την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο βιομοριακών αντιδράσεων, μέσω της καταγραφής των μεταβολών του φάσματος συμβολής του φωτός που ανακλάται από ψηφίδα πυριτίου που φέρει υμένιο SiO2. O προσδιορισμός πολλαπλών αναλυτών επιτεύχθηκε με τη χρήση ψηφίδων που φέρουν περιοχές SiO2 διαφορετικού πάχους, σε καθεμία από τις οποίες ακινητοποιείται πρωτεϊνικό σύζευγμα διαφορετικής μυκοτοξίνης. Για τον προσδιορισμό διαβιβάζεται στη ψηφίδα, μίγμα προτύπου διαλύματος ή δείγματος δημητριακών (αραβοσίτου ή σιταριού), με διάλυμα που περιέχει τα ειδικά κατά των μυκοτοξινών αντισώματα και ακολουθεί διαβίβαση δευτέρου αντισώματος για την ενίσχυση του σήματος. Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, λαμβάνεται ένα φάσμα ανάκλασης από όλες τις περιοχές τις ψηφίδας και ειδικός αλγόριθμος προσδιορίζει το πάχος που αντιστοιχεί σε κάθε μία από αυτές, για την παρακολούθηση των αντιδράσεων. Η μέθοδος του ταυτόχρονου προσδιορισμού των τριών μυκοτοξινών ήταν ταχεία (12 min), με όρια ανίχνευσης 0.07, 1.25 και 1.0 ng/mL για AFB1, DON και FB1 αντίστοιχα, και δυναμικές περιοχές που εκτείνονταν έως τα 4.0, 250 και 50 ng/mL, αντίστοιχα. Λόγω απουσίας κινούμενων εξαρτημάτων, ο αναπτυχθείς αισθητήρας ταυτόχρονου προσδιορισμού πολλαπλών αναλυτών αναμένεται να αποτελέσει τη βάση φορητής συσκευής για τον επιτόπιο προσδιορισμό αναλυτών.